यहां, हम एक सर्कैडियन दिवस के लिए ड्रोसोफिला को सिंक्रोनाइज़ करने के तरीके का विस्तार करते हैं। यह जैविक लय और क्रोनोबायोलॉजी का अध्ययन करने के लिए आवश्यक पहला, और सबसे महत्वपूर्ण कदम है।
जीवों के बीच लगभग सार्वभौमिक, सर्कैडियन लय सूर्य के चारों ओर पृथ्वी की कक्षा में जैविक गतिविधि का समन्वय करते हैं। इस लय को बनाने वाले कारकों की पहचान करने और परिणामस्वरूप आउटपुट को समझने के लिए, परिभाषित सर्कैडियन समय-बिंदुओं के लिए मॉडल जीवों की उत्पन्नता की आवश्यकता है। यहां हम एक परिभाषित सर्कैडियन लय के लिए कई ड्रोसोफिला को प्रशिक्षित करने के लिए एक प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। इसके अलावा, हम इम्यूनोफ्लोरेसेंस, न्यूक्लिक एसिड, या प्रोटीन निष्कर्षण आधारित विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करने के लिए पोस्ट-एनट्रेनमेंट चरणों का विस्तार करते हैं।
पृथ्वी पर लगभग सभी जीवों, सबसे बड़े नीचे से एक कोशिकित तक, एक आंतरिक जैविक घड़ी है जिसमें लगभग एक दिन का चक्र होता है। यह सर्कैडियन ताल के रूप में जाना जाता है (लैटिन शब्दों से फ्रांज हैलबर्ग द्वारा 1 9 53 में गढ़ा गया = लगभग और “मर जाता है” = दिन)1। यद्यपि कोर घड़ी के घटक ज्ञात हैं और कार्य के उनके प्रारंभिक तंत्र की अवधारणा है, फिर भी यह समझने के लिए बहुत कुछ है कि पूरे शरीर में जैविक लय कैसे बनाए रखी जाती है। महत्वपूर्ण बात यह है कि जैविक लय का गलतीकरण खराब स्मृति गठन, नींद विकारों, मौसमी प्रभाव विकार, अवसाद, द्विध्रुवी विकार, मधुमेह, मोटापा, न्यूरोडिजनरेशन, और कैंसर2,,3,4,5सहित खराब स्वास्थ्य परिणामों से जुड़ा हुआ है।,,
ड्रोसोफिला सर्कैडियन जीव विज्ञान की जांच के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल है। आनुवंशिक और जैव रासायनिक रूप से ट्रैक्टेबल, बड़ी संख्या आसानी से प्रशिक्षित होती है (जैसा कि दिखाया जाएगा)। वास्तव में, सर्कैडियन लय की खोज के लिए नोबेल पुरस्कार प्रदान करने में समर्थन के प्रमुख प्रकाशनों के रूप में उद्धृत सभी सात प्रकाशनों ने ड्रोसोफिला मॉडल 6 ,7, 8 , 9,,,10,811,1211,कीइन शक्तियों का लाभउठाया।
इसके अतिरिक्त, हम या तो इम्यूनोफ्लोरेसेंस, न्यूक्लिक एसिड, या प्रोटीन निष्कर्षण आधारित विश्लेषण के प्रयोजनों के लिए प्रशिक्षित मक्खियों को इकट्ठा करने के लिए प्रभावी रणनीतियों को दिखाते हैं। इन रणनीतियों का उपयोग करना, एक प्रक्रिया और भविष्य में विश्लेषण के लिए नमूनों की बड़ी मात्रा में स्टोर कर सकते हैं । ये विधियां बहुत फायदेदार हैं कि वे प्रजनन योग्य हैं और सैकड़ों प्रशिक्षित मक्खियों को प्राप्त कर सकते हैं जो एक बड़े डेटा पूल का हिस्सा हो सकते हैं।
शोधकर्ता इस एनट्रेनमेंट प्रोटोकॉल का उपयोग सफलता और स्थिरता के साथ करते हैं। यह प्रक्रिया एक बड़े नमूना पूल के निर्धारण की अनुमति देती है जिसे भविष्य के विश्लेषण के लिए संग्रहीत किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, यह रणनीति भविष्य की परीक्षा के लिए एनट्रेनमेंट द्वारा प्रेरित न्यूरोलॉजिकल पैटर्न को बरकरार रखती है।
भंडारण के लिए निर्धारण एनट्रेनमेंट प्रक्रिया का एक प्रमुख घटक है क्योंकि यह मस्तिष्क के ऊतकों को स्थिर करने में मदद करता है और यह डेटा पूल से प्रत्येक मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए अधिक समय की अनुमति देता है इस प्रकार दिमाग से अपशिष्ट को कम करता है जो21वर्ष की आयु के कारण व्यवहार्यता खो देता है। मुख्य लक्ष्य के रूप में संभव के रूप में कई मक्खियों के रूप में सर्कैडियन entrain इतना है कि वहां लगातार सिर विच्छेदन और अंततः इम्यूनोफ्लोरेसेंस या प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपलब्ध है निष्कर्षों का निरीक्षण और निर्धारित अगर परिणाम उच्च विश्वास के हैं । यह सुनिश्चित करने के लिए कि सर्कैडियन एनट्रेनमेंट को निर्धारण के माध्यम से संरक्षित किया जाता है, यह अभिन्न है कि प्रकाश प्रदूषण का कोई भी स्रोत समाप्त हो जाता है। निर्धारण प्रक्रिया ड्रोसोफिला को अपने न्यूरोलॉजिकल “टाइमस्टैंप” को बनाए रखते हुए संग्रहीत करने की अनुमति देती है ताकि उन्हें बाद में विच्छेदित किया जा सके और उन मक्खियों के लिए कोई उल्लेखनीय अंतर के साथ विश्लेषण किया जा सके जो विच्छेदित होते हैं और विलोपन के तुरंत बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस से गुजरे हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस से पहले निर्धारण के प्रयोजनों के लिए, प्रयोगशाला ने स्थिरता के साथ निर्धारित किया है कि मक्खियों कम से कम 1 महीने तक व्यवहार्य हैं। पश्चिमी दाग प्रोटीन निष्कर्षण के लिए फिक्सेशन-80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर दिमाग को अनिश्चित काल के लिए व्यवहार्य बना देता है।
एक और महत्वपूर्ण प्रोटोकॉल कदम मक्खियों की सेक्सिंग है। यह महत्वपूर्ण है कि यह कदम सही तरीके से किया जाता है क्योंकि निर्धारण से पहले एक ही शीशी में दोनों लिंगों को संभोग करना पड़ सकता है, जो नई मक्खियों को उत्पन्न करेगा जो छोटी उम्र और भ्रष्ट प्रोटीन विश्लेषण के होते हैं यदि पुरुषों की गलती से महिलाओं के बजाय जांच की जाती है या इसके विपरीत। इसके अतिरिक्त, सेक्सिंग करते समय लार्वा नमूनों को हटाना महत्वपूर्ण है जो कई बार महिलाओं से जुड़े होते हैं। यह महिला शीशी के अंदर नई संतान के विकास को रोकता है जो संभावित रूप से भ्रष्ट परिणाम दे सकता है।
एनट्रेनमेंट प्रोटोकॉल के लिए अगला कदम डेटा विश्लेषण से संबंधित वस्तुओं के साथ हो सकता है। प्रोटोकॉल का ध्यान प्रोटीन स्थानीयकरण है, लेकिन यदि अन्य चर हैं जो सर्कैडियन एनट्रेनमेंट से प्रभावित होते हैं, तो उन्हें नए रास्ते के माध्यम से पता लगाया जाना चाहिए, अक्सर प्रोटीन या न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क के अन्य प्रोटीन हैं जिनका विश्लेषण अभी भी इस प्रोटोकॉल के माध्यम से किया जा सकता है। प्रोटोकॉल से जुड़े प्रयोगों में कुछ प्रोटीन का विश्लेषण किया गया लेकिन सर्कैडियन जीव विज्ञान में भूमिका निभाने वाले जीन और प्रोटीन की सूची खत्म नहीं हुई है । प्रोटोकॉल एक सर्कैडियन लय स्थापित करने के लक्ष्य को पूरा करने में प्रभावी है, हालांकि, अनुप्रयोगों को व्यापक रूप से कर रहे हैं ।
The authors have nothing to disclose.
मिसौरी विश्वविद्यालय-कंसास सिटी और जेफरी एल मूल्य प्रयोगशाला के लिए विशेष धन्यवाद।
100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |