Her beskriver vi hvordan vi synkroniserer Drosophila til en circadian dag. Dette er det første og viktigste trinnet som er nødvendig for å studere biologiske rytmer og kronologi.
Nesten universelle blant organismer koordinerer døgnrytmen biologisk aktivitet til jordens bane rundt solen. For å identifisere faktorer som skaper denne rytmen og for å forstå de resulterende utgangene, er det nødvendig med entrainment av modellorganismer til definerte circadian tidspunkter. Her beskriver vi en prosedyre for å trene mange Drosophila til en definert døgnrytme. Videre beskriver vi ettertreningstrinn for å forberede prøver for immunofluorescence, nukleinsyre eller proteinutvinningsbasert analyse.
Nesten alle organismer på jorden, fra den største ned til enkeltcellet, har en intern biologisk klokke med en syklus på omtrent en dag. Dette er kjent som døgnrytmen (skapt i 1953 av Franz Halberg fra de latinske termene circa = om / omtrent og “dør” = dag)1. Selv om komponenter i kjerneklokken er kjent og deres rudimentære funksjonsmekanismer konseptualisert, er det fortsatt mye å forstå om hvordan biologiske rytmer opprettholdes i hele kroppen. Viktigere, feilregulering av biologiske rytmer er forbundet med dårlige helseutfall, inkludert dårlig minnedannelse, søvnforstyrrelser, sesongmessige lidelser, depresjon, bipolar lidelse, diabetes, fedme, nevrodegenerasjon og kreft2,,3,,4,,5.
Drosophila er en veletablert modell for undersøkelse av circadian biologi. Genetisk og biokjemisk tractable, store tall er lett innkadert (som vil bli vist). Faktisk, alle syv publikasjoner sitert som viktige publikasjoner av støtte i tildeling av Nobelprisen for oppdagelsen av døgnrytmer utnyttet disse styrkene til Drosophila modell6,7,8,9,10,11,12.
I tillegg viser vi effektive strategier for å samle inn innrente fluer i forbindelse med enten immunofluorescence, nukleinsyre eller proteinutvinningsbasert analyse. Ved hjelp av disse strategiene kan man behandle og lagre større mengder prøver for analyse i fremtiden. Disse metodene er svært fordelaktige ved at de er reproduserbare og kan gi hundrevis av innrente fluer som kan være en del av et stort datautvalg.
Forskere benytter denne entrainment protokollen med suksess og konsistens. Denne prosedyren gjør det mulig å fikse et stort utvalgsutvalg som kan lagres for fremtidig analyse. I tillegg bevarer denne strategien de nevrologiske mønstrene indusert av entrainment for fremtidig undersøkelse.
Fiksering for lagring er en viktig del av entrainment prosessen som det bidrar til å stabilisere hjernevev og det gir mer tid til å analysere hver hjerne fra datautvalget og dermed minimere avfall fra hjernen som mister levedyktighet på grunn avalder 21. Hovedmålet er å circadian entrain så mange fluer som mulig, slik at det er kontinuerlig inventar tilgjengelig for hode disseksjoner og til slutt immunofluorescence eller protein utvinning for å observere funnene og avgjøre om resultatene er av høy tillit. For å sikre at circadian entrainment bevares gjennom fiksering, er det integrert at enhver kilde til lysforurensning elimineres. Fikseringsprosessen gjør det mulig for Drosophila å bli lagret samtidig som den opprettholder sitt nevrologiske “tidsstempel” slik at de kan dissekeres senere og analyseres uten merkbare forskjeller til fluer som dissekeres og har gjennomgått immunofluorescence umiddelbart etter trening. I forbindelse med fiksering før immunofluorescence har laboratoriet bestemt med konsistens at fluer er levedyktige minst opptil 1 måned. Fikseringer for vestlige flekkproteinekstraksjon gjør hjernen levedyktig på ubestemt tid når den oppbevares ved -80 °C.
Et annet kritisk protokolltrinn er sexing av fluene. Det er viktig at dette trinnet gjøres nøyaktig som å ha begge kjønn i samme hetteglass før fiksering kan føre til parring, noe som vil gi nye fluer som er av yngre alder og korrupt proteinanalyse hvis menn ved et uhell undersøkes i stedet for kvinner eller omvendt. I tillegg, når du sexing er det viktig å fjerne larverprøver som til tider er festet til kvinner. Dette forhindrer utvikling av nye avkom inne i det kvinnelige hetteglasset som potensielt kan ødelegge resultatene.
Det neste trinnet for entrainment-protokollen kan være med elementer relatert til dataanalyse. Fokuset i protokollen er protein lokalisering, men hvis det er andre variabler som påvirkes av circadian entrainment, må de utforskes gjennom nye veier, ofte krever protein eller nukleinsyre utvinning. I tillegg er det andre proteiner i hjernen som fortsatt kan analyseres via denne protokollen. Eksperimentene knyttet til protokollen analyserte visse proteiner, men listen over gener og proteiner som spiller en rolle i circadian biologi er ikke oppbrukt. Protokollen er effektiv i å oppnå målet om å etablere en døgnrytme, men søknadene er omfattende.
The authors have nothing to disclose.
Spesiell takk til University of Missouri-Kansas City og Jeffrey L. Price laboratoriet.
100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |