Überwachtes maschinelles Lernen zur Semiquantifizierung der extrazellulären DNA bei Glomerulonephritis
Summary
Extrazelluläre DNA (ecDNA), die während des Zelltodes freigesetzt wird, ist proinflammatorische und trägt zu Entzündungen bei. Die Messung von ecDNA an der Verletzungsstelle kann die Wirksamkeit der therapeutischen Behandlung im Zielorgan bestimmen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines Machine Learning-Tools zur Automatisierung der Messung von ecDNA im Nierengewebe.
Abstract
Der Glomeruläre Zelltod ist ein pathologisches Merkmal der Myeloperoxidase anti neutrophilen zytoplasmatischen Antikörperassoziierten Vaskulitis (MPO-AAV). Extrazelluläre Desoxyribonukleinsäure (ecDNA) wird bei verschiedenen Formen des Zelltodes freigesetzt, einschließlich Apoptose, Nekrose, Nekroptose, neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs) und Pyroptose. Die Messung dieses Zelltodes ist zeitaufwändig, wobei mehrere verschiedene Biomarker erforderlich sind, um die verschiedenen biochemischen Formen des Zelltodes zu identifizieren. Die Messung von ecDNA wird in der Regel in Serum und Urin als Ersatz für Nierenschäden durchgeführt, nicht im eigentlichen Zielorgan, wo die pathologische Verletzung auftritt. Die aktuelle Schwierigkeit bei der Untersuchung von ecDNA in der Niere ist das Fehlen von Methoden für formalin fixiertes Paraffin-eingebettetes Gewebe (FFPE) sowohl experimentell als auch in archivierten menschlichen Nierenbiopsien. Dieses Protokoll bietet eine Zusammenfassung der Schritte, die erforderlich sind, um für ecDNA in FFPE-Gewebe (sowohl menschliche als auch murine), abschrecken Autofluoreszenz und messen die ecDNA in den resultierenden Bildern mit einem Machine Learning-Tool aus der öffentlich verfügbaren Open-Source-ImageJ-Plugin trainable Weka Segmentierung. Die trainierbare Weka-Segmentierung wird auf ecDNA innerhalb der Glomeruli angewendet, wo das Programm lernt, ecDNA zu klassifizieren. Dieser Klassifizierer wird auf nachfolgende erworbene Nierenbilder angewendet, wodurch die Notwendigkeit manueller Anmerkungen für jedes einzelne Bild reduziert wird. Die Anpassungsfähigkeit der trainierbaren Weka-Segmentierung wird weiter im Nierengewebe von experimenteller muriner Anti-MPO-Glomerulonephritis (GN) nachgewiesen, um NETs und ecMPO, häufige pathologische Mitwirkende an Anti-MPO GN, zu identifizieren. Diese Methode bietet eine objektive Analyse von ecDNA im Nierengewebe, die die Wirksamkeit deutlich zeigt, in der das trainierbare Weka-Segmentierungsprogramm ecDNA zwischen gesundem normalem Nierengewebe und krankem Nierengewebe unterscheiden kann. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um ecDNA, NETs und ecMPO in anderen Organen zu identifizieren.
Introduction
Myeloperoxidase anti neutrophile zytoplasmatische Antikörper assoziierte Vaskulitis (MPO-AAV) ist eine Autoimmunerkrankung, die zu Nierenversagen von pathologischen glomerulären Verletzungen mit erheblichem Zelltod und Freisetzung von Desoxyribonukleinsäure (DNA)1,2führt. DNA kann das Immunsystem aktivieren, indem sie als Gefahrensignal fungiert. Unter normalen gesunden Bedingungen bietet die nukleare Lage der DNA Schutz vor der Exposition gegenüber dem Immunsystem. Selbst-DNA, die extrazellulär während entweder pathogener Prozesse oder Autoimmunität freigesetzt wird, wird vom Immunsystem als eine potente proinflammatorische Schädigung assoziierter molekularer Selbstprotein (DAMP)3gesehen. Extra zelluläre DNA (ecDNA) wird aus sterbenden Zellen durch mehrere verschiedene Mechanismen freigesetzt, die durch verschiedene biochemische Bahnen gesteuert werden, wie Apoptose, Nekrotophile extrazelluläre Trapbildung (NETs), Nekrose oder Pyroptose4,5,6,7,8.
Wir beschreiben hierin Methoden zur Färbung und Messung von ecDNA, die aus sterbenden Zellen in Abschnitten von formalin fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Nieren von experimentellen Anti-MPO-GN- und Nierenbiopsien von Patienten mit MPO-AAV9,10freigesetzt werden. Es gibt mehrere Methoden zum Nachweis von zirkulierender doppelsträngiger DNA (dsDNA) und DNA-Komplexen aus Serum und Urin sowie aus In-vitro-Assays11,12. Diese Methoden, obwohl genau bei der Bestimmung der Menge an ecDNA, bestimmen nicht, wo die ecDNA anatomisch freigesetzt wird. Es gibt Methoden, die spezifische Messung von ecDNA wie Tunel für Apoptose und Messung von Zellablagerungen13,14beschreiben. Es gibt keine Methode, die die Messung von ecDNA beschreibt, die aus allen Formen des Zelltodes in FFPE-Nieren gegipfelt, wo die pathologische Schädigung auftritt. Dies ist wichtig, um festzustellen, ob experimentelle therapeutische Behandlungen die ecDNA von den Stellen der pathologischen Verletzung im eigentlichen Zielorgan löschen.
Die Erfassung mehrerer Bilder aus Nierenproben erzeugt ein hohes Datenvolumen, das häufig von einem einzelnen Benutzer analysiert wird. Dies ist arbeitsintensiv, zeitaufwändig und kann aufgrund von Voreingenommenheit des Benutzers einer unzuverlässigen Reproduzierbarkeit durch andere Benutzer unterliegen. Trainable Weka Segmentierung ist ein Open-Source-Software-Plugin für ImageJ, das modernste bioinforschende Werkzeuge verwendet, um Pixel mit Machine Learning-Algorithmen15,16zu klassifizieren. Diese Methode ist “trainierbar”, wobei sie aus der Klassifizierung von Pixelsegmenten des Benutzers lernt und die neu gelernte Klassifizierung auf andere Bilder anwendet. Diese Methode basiert auf gängigen Analysewerkzeugen innerhalb des ImageJ-Programms, die verwendet werden, um jedes Pixel in einem Segment als zu einer bestimmten “Klasse” gehörend zu “klassifizieren”. Sobald das Programm die “Klassifikatoren” erlernt hat, können sie verwendet werden, um andere ähnliche klassifizierte Segmente innerhalb desselben Bildes zu identifizieren. Dieses Modell wird dann gespeichert und auf andere Bildsätze innerhalb desselben Experiments angewendet.
Aktuelle Hindernisse bei der Bestimmung von ecDNA in situ in Nierenabschnitten ist die endogene Autofluoreszenz durch Fixierung im Formalin und die arbeitsintensive Analyse der Bilder. Wir beschreiben hier, wie diese Autofluoreszenz zu löschen, zu erkennen ecDNA, und verwenden überwachtes maschinelles Lernen für hohe Durchsatzmessung von ecDNA. Wir haben bereits die Messung von NETs und extrazellulärem MPO (ecMPO) mit einem Makro in ImageJ veröffentlicht, wir demonstrieren jetzt die Halbautomatisierung dieser Methoden mit überwachtem maschinellem Lernen1. Wir zeigen die Anpassungsfähigkeit des Machine Learning Tools, um einen alternativen Fleck für NETs und ecMPO innerhalb desselben Bildes zu klassifizieren. Diese hier beschriebenen Färbemethoden zum Nachweis von ecDNA, NETs und ecMPO können in andere feste Organe und Krankheiten übersetzt werden, bei denen ecDNA, NETS und ecMPO eine Rolle bei der Aufrechterhaltung von Krankheiten wie rheumatoider Arthritis und Lupus17,18spielen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Protokolle, die proinflammatorische Marker im Serum und Urin von Patienten und Mausmodellen der Glomerulonephritis messen. Dieses beschriebene Protokoll ermöglicht die direkte Analyse der Produkte des Zelltodes (ecDNA, NETs und ecMPO) innerhalb des Glomerulus. Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die Gewebevorbereitung und -bildgebung. Das wichtigste einschränkende Element der Verwendung einer fluoreszierenden Färbungsmethode für die Analyse ist die Gewebe-Autofluoreszenz. Formalin fixier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen Monash Micro Imaging für den Einsatz des aufrechten Konfokallaser-Scanning-Mikroskops Nikon C1 und der Monash Histology Platform für die Verarbeitung von Nierengewebe.
Materials
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A2153 | 5% and 1% solutions are made up in PBS, can be made in bulk and frozen- discard once thawed. |
| Chicken anti Goat IgG (H+L) cross absorbed antibody Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-21468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti mouse IgG (H+L) cross absorbed antibody, Alex Fluor 647 | ThermoFisher Scientific | A-121468 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken anti rabbit IgG (H+L) Cross absorbed antibody Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-21441 | Spin in mini centrifuge for 1 minute prior to use to avoid any free conjugate in your antibody cocktail |
| Chicken sera | SIGMA | C5405 | Made up in 1%BSA/PBS |
| Coverslips 24 x60 mm | Azerscientific | ES0107222 | #1.5 This is not standard thickness- designed for use in confocal microscopy |
| EDTA 10mM | SIGMA | E6758 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x Solution |
| Ethanol 30%, 70% and 100% | Chem Supply | UN1170 | Supplied as 100% undenatured ethanol- dilute to 30% and 70% using distilled water |
| Formaldehyde, 4% (10% Neutral buffered Formalin) | TRAJAN | NBF-500 | Kidney is put into a 5ml tube containing 3ml of formalin for 16 hours at RT, formalin should be used in a fume hood |
| Glass histology slides- Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25×75 x1.0mm | TRAJAN | J3800AM4 | Using positive charged coated slides is essential. We do not recommend using poly-L-lysine for coating slides as tissue dislodges from slides during the antigen retrieval step |
| Goat anti human/mouse MPO antibody | R&D | AF3667 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Histosol | Clini Pure | CPL HISTOSOL 08 | Used neat, in 200ml staining rack containers, use in a fume hood |
| Hydrophobic pen | VECTOR Labs | H-400 | Use to draw circle around kidney tissue |
| Mouse anti human/mouse Peptidyl arginase 4 (PAD4) | ABCAM | ab128086 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Nikon C1 confocal scanning laser head attached to Nikon Ti-E inverted Microscope | Coherent Scientific | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival | |
| Phosphate Buffered Saline | SIGMA | P38135 | 0.01M PB/0.09% NaCl Make up 5L at a time |
| Pressure Cooker 6L Tefal secure 5 Neo stainless | Tefal | GSA-P2530738 | Purchased at local homeware store |
| Prolong Gold DAPI | Life Technologies | P36962 | Apply drops directly to coverslip |
| Rabbit anti human/mouse Beta Actin antibody | ABCAM | ab8227 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Rabbit anti human/mouse H3Cit antibody | ABCAM | ab5103 | Aliquot and freeze at minus 80 degrees upon arrival |
| Staining rack 24 slides | ProScitech | H4465 | Staining rack chosen has to be able to withstand boiling under pressure and incubation in 60 degree oven |
| Sudan Black B | SIGMA | 199664 | 0.3% Add 3g to a 1L bottle in 70% Ethanol, filter and protect from the light- stable for 6 months at room temperature |
| Tris 10mM | SIGMA | T4661 | Add TRIS and EDTA together in distilled water and pH to 9, for antigen retrieval, can be made up in a 10x solution |
| Xylene | Trajan | XL005/20 | Must be use used in a fume hood |
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