小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

摘要

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。

摘要

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经发生关键机制并可能促进再生医学研究的有力工具。本文建立了一种高效且低成本的小鼠胚胎干细胞体外神经元分化方法。, 采用组合筛选策略。在本方案所定义的条件下，经过2天的拟胚体形成和6天的视黄酸诱导，可实现小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经前体细胞（NPCs）的快速高效分化，表现为形成结构紧密、具有神经突样形态且Nestin阳性的A2lox和129系衍生物。拟胚体的健康状态、视黄酸（RA）处理的时间点以及RA浓度均对分化过程至关重要。在后续由NPCs向神经元的分化过程中，N2B27培养基II（添加Neurobasal培养基）更有利于神经元细胞的长期维持与成熟。该方法效率高、成本低、操作简便，可成为神经生物学与发育生物学研究的有力工具。

引言

胚胎干细胞（ESCs）具有多能性，在特定条件下可分化为神经前体细胞（NPCs），并进一步分化为神经元¹基于ESC的神经发生为模拟神经发生过程提供了最佳平台，因此可作为一种有效的工具 发育生物学研究，并可能助力再生医学^2,3在过去的几十年中，已有多种诱导胚胎神经发生的方法被报道，例如转基因方法⁴，使用小分子⁵，使用三维基质微环境⁶，以及共培养技术⁷然而，这些方案大多受限于特定条件或操作难度较高，因此不适合在大多数实验室中使用。

为了寻找一种操作简便且成本低廉的方法，以实现从小鼠胚胎干细胞（mESCs）高效地进行神经分化，本研究采用了组合筛选策略。如图1所示，将整个胚胎神经发生过程分为两个阶段。第一阶段（Phase I）指mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化的过程，第二阶段（Phase II）则涉及NPCs进一步向神经元的后续分化。根据操作简便、成本低、材料易得以及高分化效率的原则，分别在第一阶段筛选了七种方案，在第二阶段筛选了三种方案，这些方案基于传统的....

方案

1. 小鼠胚胎干细胞培养

1. 制备0.1%明胶包被的细胞培养皿或培养板。
   1. 向60 mm细胞培养皿中加入2 mL灭菌的0.1%明胶溶液（0.1% w/v，溶于水），轻轻摇晃培养皿以确保表面均匀包被。
   2. 将培养皿放入5% CO₂培养箱中₂ 37 °C 培养箱中孵育 1 小时以完成包被。
   3. 在接种细胞前，移除0.1%明胶溶液。
      注意：去除明胶后，无需干燥或洗涤包被的培养皿。
2. 小鼠胚胎干细胞（A2lox 和 129）培养
   1. 将mESCs（A2lox和129）细胞接种于经0.1%明胶包被的60 mm细胞培养皿中，加入mESC生长培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 培养箱中分别培养。mESC生长培养基由85%的Knock-out DMEM/F12、15% Knock-out血清替代物（KSR）、0.1 mM β-巯基乙醇（2ME）、2 mM GlutaMAX、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）组成。
      注意：β-mercaptoethanol 具有可燃性，且吸入有毒。使用时应远离火源，并佩戴口罩以避免吸入。
   2. 每天更....

结果

2天类胚体形成+6天视黄酸诱导在促进mESCs向NPCs分化方面效果最佳（第一阶段）。为确定最有利于mESCs向NPCs分化的最佳方案（第一阶段），在A2lox和129两种mESCs系中测试了7种不同方案（表1），并通过光学显微镜监测各组细胞的分化状态。如图3A所示，在“2天类胚体形成+6天视黄酸诱导”处理组（第一阶段方案3）中，大多数A2lox和129细胞系的衍生物呈现出紧密堆积且具有神经突样形态，表明已形成NPCs。然而，在“4天类胚体形成+4天视黄酸诱导”处理组（第一阶段方案2）中，细胞状态较差并出现凋亡现象，可能由于类胚体内部营养不足所致。单层培养结合视黄酸诱导（第一阶段方案4和5）也可引导mESCs分化，但神经突样细胞的比例不及第一阶段方案3。同时，第一阶段方案6和7中的大多数A2lox和129衍生物细胞胞体较小，并倾向于发生凋亡，提示N2B27培养基II不能有效支持胚胎神经发生。

为了进一步确认神经前体细胞（NPCs）的形成，采用免疫荧光检测各组中Nestin阳性细胞（NPCs.......

讨论

在本研究中，我们建立了一种简单且高效的从小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经元分化的诱导方法，该方法成本低且所需材料易于获取。该方法中，先进行2天的拟胚体形成，随后进行6天的视黄酸（RA）诱导，可有效促进mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化（I阶段-方案3）。在II阶段分化中，N2B27培养基II（II阶段-方案3）对NPCs向神经元的分化诱导效果最佳。为确保实验成功，需特别关注若干关键步骤。

首先，类胚体的健康状态是整个分化过程的关键。三维类胚体的形成通常用于引导胚胎干细胞的分化⁸。在本研究中，我们探讨了类胚体悬浮培养的合适时间。如图2所示，在该条件下悬浮培养2天后，形成了具有明亮核心的圆形类胚体。然而，当培养4天时，许多类胚体相互黏连，且其核心变暗，表明核心细胞发生了凋亡。后续的分化结果进一步证实了延长类胚体形成时间所带来的不良影响。在一些已有报道的研究中，类胚体的悬浮培养时间可长达10天，但所用培养基中胎牛血清（FBS）浓度较低或不含FBS

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗巢蛋白抗体 [大鼠-401]	Abcam	Ab11306	保存于 -80 °C，避免反复冻融
兔源抗β-微管蛋白 III 抗体	Sigma Aldrich	T2200	保存于 -80 °C，避免反复冻融
Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠 IgG	Beyotime	A0428	保存于 -20 °C，并避光
B-27 补充剂（50X），无血清	Gibco	17504044	保存于 -20 °C，并避光
CHIR-99021 (CT99021)	Selleck	S1263	保存于 -20 °C
盖玻片	NEST	801007
Cy3 标记山羊抗兔 IgG	Beyotime	A0516	保存于 -20 °C，并避光
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	保存于 4 °C
胎牛血清	HyClone	SH30084.03	保存于 -20 °C，避免反复冻融
荧光显微镜	Olympus	CKX53
明胶	Gibco	CM0635B	室温保存
GlutaMAX 补充剂	Gibco	35050061	保存于 4 °C
免疫染色一抗稀释缓冲液	Beyotime	P0103	保存于 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	保存于 4 °C
KnockOut 血清替代物	Gibco	10828028	保存于 -20 °C，避免反复冻融
人白血病抑制因子	Sigma	L5283	保存于 -20 °C
含 DAPI 的水性封片剂（Fluoroshield）	Abcam	ab104139	保存于 4 °C，并避光
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140076	保存于 4 °C
N-2 补充剂 (100X)	Gibco	17502048	保存于 -20 °C，并避光
正常山羊血清	Jackson	005-000-121	保存于 -20 °C
Neurobasal 培养基	Gibco	21103049	保存于 4 °C
非粘附性细菌培养皿	Corning	3262
磷酸盐缓冲液 (1X)	HyClone	SH30256.01B	保存于 4 °C
青霉素/链霉素溶液	HyClone	SV30010	保存于 4 °C
PD0325901（Mirdametinib）	Selleck	S1036	保存于 -20 °C
视黄酸	Sigma	R2625	保存于 -80 °C，并避光
129 品系小鼠胚胎干细胞	Cyagen	MUAES-01001	维持于无饲养层培养体系中
干细胞冻存液（无 DMSO）	ZENOAQ	stem cellbanker DMSO free	保存于 -20 °C，避免反复冻融
0.25% 胰蛋白酶 (1X) 溶液	HyClone	SH30042.01	保存于 4 °C
吐温 X-100	Sigma	T8787
2-巯基乙醇	Gibco	21985023	保存于 4 °C，并避光
4% 多聚甲醛	Beyotime	P0098	保存于 -20 °C
6 孔板	Corning	3516
60 mm 细胞培养皿	Corning	430166
15 ml 离心管	NUNC	339650