Beskrivet är cellkultur och exponeringsmetod för en in vitro bronkial modell för realistisk, upprepad inandningsexponering för partiklar för toxicitetstestning.
För toxicitetstestning av luftburna partiklar har ali-exponeringssystem (Air-Liquid Interface) utvecklats för in vitro-tester för att efterlikna realistiska exponeringsförhållanden. Detta ställer specifika krav på cellkulturmodellerna. Många celltyper påverkas negativt av exponering för luft (t.ex. uttorkning) och förblir endast livskraftiga i några dagar. Detta begränsar de exponeringsförhållanden som kan användas i dessa modeller: vanligtvis tillämpas relativt höga koncentrationer som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar, som sätter sig snabbt) inom en kort tidsperiod. Sådana experimentella tillstånd återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. För att övervinna dessa begränsningar undersöktes användningen av en mänsklig bronkial epitelial cellinje, Calu-3. Dessa celler kan odlas vid ALI-förhållanden i flera veckor samtidigt som de behåller en hälsosam morfologi och ett stabilt monoskikt med snäva korsningar. Dessutom är denna bronkialmodell lämplig för att testa effekterna av upprepade exponeringar för låga, realistiska koncentrationer av luftburna partiklar med hjälp av ett ALI-exponeringssystem. Detta system använder ett kontinuerligt luftflöde i motsats till andra ALI-exponeringssystem som använder en enda nebulisering som producerar ett moln. Därför är det kontinuerliga flödessystemet lämpligt för upprepad och långvarig exponering för luftburna partiklar samtidigt som partikelegenskaper, exponeringskoncentration och levererad dos kontinuerligt övervakas. Sammantaget kan denna bronkialmodell, i kombination med det kontinuerliga flödesexponeringssystemet, efterlikna realistiska, upprepade inhalationsexponeringsförhållanden som kan användas för toxicitetstestning.
Lungorna är sårbara för inandningsexponering för luftburna partiklar. För att bedöma den potentiella toxiciteten hos luftburna partiklar har framsteg gjorts för att utveckla luft-vätskegränssnitt (ALI) exponeringssystem1,2,3,4,5. ALI-exponeringssystem möjliggör mer relevanta och realistiska exponeringsmodeller jämfört med traditionell nedsänkt exponering via odlingsmedium som ändrar partiklarnas egenskaper ochkinetik 6. ALI-exponeringssystemen ställer specifika krav på cellkulturmodellerna, eftersom modellerna saknar odlingsmedium och därmed näringsämnen på den apatiska sidan. Många cellmodeller påverkas negativt av att odlas och exponeras i luften (t.ex. uttorkning) och förblir bara livskraftiga i några dagar. Detta begränsar de exponeringsförhållanden som kan användas i dessa modeller: vanligtvis tillämpas relativt höga koncentrationer inom en kort tidsperiod som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar, som sätter sig snabbt). Sådana försöksbetingade tillstånd återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. Resultatens relevans kan således ifrågasättas. För att övervinna dessa begränsningar optimerades kultur- och exponeringsprotokollet för en bronkial modell bestående av den mänskliga bronkial epitelial cellinjen Calu-37.
De flesta in vitro-lungmodeller som används för ALI-exponering innehåller andra cellinjer som A549, BEAS-2B och 16HBE14o- (16HBE) eller primärceller som grund8. Dessa cellinjer har nackdelen att de förblir livskraftiga i bara några dagar när de odlas på ALI. Dessutom växer vissa av dessa cellinjer när de odlas under en period längre än 5 dagar. Slutligen saknar A549-celler funktionella snäva korsningar och kan därför inte bilda en tät barriär som behövs för att efterliknalungorna 9,10. Primära epitelceller kan vara ett bra alternativ för ALI-exponering eftersom de kan odlas vid ALI i veckor. Primärceller skiljer sig dock från parti till parti, är svårare att underhålla och dyrare jämfört med cellinjer, vilket gör dem mindre lämpliga för toxicitetstestning och screening. Vid jämförelse av olika humana bronkial epitelial cellinjer (16HBE, Calu-3, H292 och BEAS-2B), endast Calu-3 celler uppfyller alla kriterier som behövs för realistisk, upprepad ALI exponering: de förblir livskraftiga i veckor medan odlas vid ALI, ger en hög barriär integritet, inte överväxt, och är lätta att odla och upprätthålla. Calu-3 celler härstammar från en adenocarcinom och kan producera slem11,12. Det finns inkonsekvenser om cellerna kan utveckla cilia11,13. Calu-3 celler är också en lämplig modell för att studera respiratoriska syncytial virus (RSV) infektioner som infekterar ciliated luftvägarna epitelceller14.
Förutom cellmodellen används ett automatiserat exponeringssystem (AES) för luft-vätskeexponering föraerosoler 15,16. AES har fördelen att den använder ett kontinuerligt luftflöde för att utsätta cellmodellen för aerosoler. Detta står i kontrast till andra luft-vätskeexponeringssystem som vanligtvis använder relativt höga koncentrationer inom en kort tidsperiod som ett moln (dvs. droppar som innehåller partiklar som sätter sig snabbt)17,18,19. Dessa molnsystem återspeglar inte realistisk långsiktig exponering för låga koncentrationer av partiklar. Genom att tillämpa ett kontinuerligt luftflöde med hjälp av AES kan cellmodellen utsättas för en låg koncentration av partiklar under en längre tidsperiod, vilket återspeglar realistiska exponeringsförhållanden. En annan fördel jämfört med molnsystem är att AES har möjlighet att ansluta partikelkarakteriseringsinstrument, vilket möjliggör mätning av partikelstorlek, talkoncentration och massa över tid. En begränsning av AES är att den använder relativt höga luftflöden mellan 10 ml/min och 100 ml/min.
Detta dokument beskriver en metod för odling av mänskliga bronkial epitelceller under ALI och exponera denna bronkial modell för aerosoler eller gaser. Fördelen med att använda Calu-3-celler är att de bildar snäva korsningar, förblir ett monoskikt, kan motstå luftflödet och kan odlas i veckor vid ALI, till skillnad från många andra celltyper (t.ex. 16HBE, H292 och BEAS-2B). Att använda VITROCELL® automatiserad exponeringsstation (AES) har fördelen att cellerna kan exponeras under realistiska och relevanta förhållanden eftersom låga koncentrationer kan appliceras med hjälp av ett kontinuerligt luftflöde.
Fortsatta flödessystem, som AES, har fördelar jämfört med att använda molnsystem3,32, som använder en enda nebulisering av en suspension. Det kontinuerliga flödet är mer realistiskt och många variabler som flödeshastighet, luftfuktighet och temperatur styrs. Dessutom kan depositionen förbättras med hjälp av ett elektriskt fält. Slutligen övervakas aerosolegenskaper som storlek, nummerkoncentration och massa online. En nackdel är att fortsatta flödessystem är mer komplexa jämfört med molnsystem. Därför är det viktigt att köra förberedande experiment som fokuserar på aerosolens partikelegenskaper och den levererade dosen på insatsen. Den initiala startkoncentrationen av partiklarna och AES-inställningarna kan sedan justeras för att uppnå önskad dos på cellerna33. Beroende på vilken typ av partiklar som testas kan aerosolgenereringsmetoden skilja sig åt. Användningen av elektrostatisk nedfall beror på partikeltypen och fungerar bäst för metallpartiklar. För partiklar med en positiv ytladdning bör ett negativt elektrostatiskt fält appliceras och vice versa.
Val av exponeringskoncentrationer kan vara svårt för alla luft-vätskeexponeringsexperiment. För DQ12-exponeringarna var målet att uppnå en total kumulativ dos på 1 μg/cm2 efter 3 veckors exponering, 5 dagar per vecka, 4 timmar per dag. Denna dos liknar doser som inducerade en effekt in vivo21,25,27,32,33. När exponeringarna utfördes fanns det en viss variation mellan olika exponeringsdagar. Även om den faktiska deponerade dosen på 1,6 μg/cm2 är högre än den 1 μg/cm2 som siktades på, kan dosen ha varit för låg för att observera effekter i Calu-3-modellen. Endast mindre skillnader i TEER, livskraft och cytokinsvar observerades mellan exponeringen för ren luft och DQ12-exponeringen, och dessa skillnader var inte statistiskt signifikanta. En förklaring till observationen att DQ12 exponering i 3 veckor inte inducera betydande effekter i Calu-3 celler är att makrofager saknades från Calu-3 modellen. Eventuellt, efter DQ12 upptag makrofager producerar proinflammatory cytokiner som kan påverka Calu-3 celler. En annan förklaring är att DQ12-partiet som användes för experimenten inte var så reaktivt som förväntat. Vid användning av LPS som positivt kontrollämne visar Calu-3 ett svar, mätt med en ökning av LDH-frisättningen och en ökning av TNF-α frisättning. Detta indikerar att modellen kan upptäcka toxicitet.
Calu-3-cellmodellen har många fördelar, vilket diskuteras i resultatavsnittet. Dessutom, när odlas under en längre tid vid ALI, kan Calu-3-cellerna växa cilia / cilia-liknande strukturer13 och producera slem11,12,13. Trots dessa fördelar har modellen begränsningar med avseende på dess fysiologiska relevans. Calu-3-cellinjerna härstammar från ett adenocarcinom, medan 16HBE och BEAS-2B härstammar från frisk vävnad. Tyvärr är de två sistnämnda inte lämpliga för upprepad ALI-exponering eftersom de inte förblir ett stabilt monoskikt över tiden. En annan begränsning av Calu-3-modellen är att den bara representerar en enda celltyp. I den mänskliga lungan finns flera celltyper som interagerar och reagerar olika på exponering. Inhalerade partiklar kommer att deponeras i olika delar av lungorna beroende på deras aerodynamiska storlek. Det är här partiklarna kommer i kontakt med epitelcellbarriären, som efterliknas av Calu-3-modellen. I den mänskliga lungan lockas alveolära makrofager till partiklarna, uppslukar dem och rensar dem från lungorna. Makrofager spelar också en viktig roll i inflammationssvaret på partikelexponering. Därför görs ansträngningar för att utöka Calu-3-modellen genom att lägga till primära makrofager för att efterlikna lungbarriären närmare. Nackdelen med makrofagerna är att de förblir livskraftiga endast i ca 7 dagar när de odlas ovanpå Calu-3-celler vid ALI. Därför bör makrofager läsas varje vecka för att omvandla den nuvarande Calu-3-modellen till en kokulturmodell. Optimeringen av kokulturprotokollet pågår för närvarande.
Mot denna ovan är Bronkialmodellen Calu-3 en lämplig modell för upprepad exponering för aerosoler av delvis lösliga ämnen som kemikalier från cigarettrök och LPS. Dessa lösliga ämnen inducerar betydande ökningar av cytokinsvaren i Calu-3-cellerna. För att testa olösliga partiklar som dieselavgaser och DQ12 behövs en kokulturmodell, eftersom makrofagerna spelar en avgörande roll för induktion av effekter genom partikelexponering.
För de beskrivna exponeringarna användes skärmembran med 3,0 μm porer. Det främsta skälet till att välja denna typ av insats är att det är möjligt att testa flyttning av nanomaterial. Vid användning av mindre 0,4 μm porstorlek kommer partikelagglomerat inte att kunna korsa insatsmembranet. Nackdelen med att använda en stor porstorlek är att cellerna behöver längre tid för att växa sammanflöde och att det är svårare att visualisera cellernas morfologi med hjälp av ljusmikroskopi. Om du vill kontrollera att cellerna bildar ett sammanflöde av monoskikt bör TEER vara >1 000 Ω x cm2 innan en exponering påbörjas.
Sammantaget är Calu-3 bronkialmodellen som presenteras här lämplig att använda för upprepad exponering för aerosoler, minst upp till 3 veckor. Modellen tål att odlas och exponeras via ett kontinuerligt luftflöde och kan upptäcka toxicitet för bronkialt epitel.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansieras av EU-projektet PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) och det nederländska ministeriet för hälsa, välfärd och idrott (projekt V/050012). Vi vill tacka Dr. Yvonne Staal och Dr. Jan van Benthem för att de kritiskt granskat manuskriptet.
0.01 M NaOH | Sigma Aldrich | S5881 | |
0.1M (x10) PBS | Gibco | 14200-059 | |
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) | Sigma Aldrich | D6883 | |
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) | Abcam | ab141525 | |
Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15290 | |
Automated exposure station | Vitrocell | ||
Cell proliferation reagent WST-1 | Roche | 11644807001 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CPC | TSI inc., St Paul MN, USA | 3022 | |
Cytotoxicity detection kit LDH | Roche | 11644793001 | |
DQ12 | IOM | nanomaterials | |
ELISA Ready-SET-Go | Fischer Scientific | 88-8086-86, 88-7399-88 | |
EVOM2 | World Precision Instruments Inc., FL, USA | EVOM2-STX2 | |
FBS | Greiner bio-one | 758093 | |
Flow splitter | TSI inc., St Paul MN, USA | model 3708 | |
Fluorescein diacetate (F-DA) | Sigma Aldrich | F7378 | |
HBSS | Thermo Fisher Scientific Inc. | 14175 | |
Light microscope | Olympus | CKX41 | |
Mass flow controllers | MFC, Bronkhorst, the Netherlands | ||
Methanol (analytical grade) | Sigma Aldrich | 34860 | |
Microbalance | Sartorius, Goettingen, Germany | ME-5 | |
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific Inc. | 41090 | |
NEAA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 11140 | |
OPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3339 | |
Pen/Strep | Thermo Fisher Scientific Inc. | 15140 | |
Phenol red free MEM | Gibco | 10500-064 | |
Pure water | Merck | MilliQ | |
SMPS | TSI inc., St Paul MN, USA | 3936 | |
Spray nozzle | Schlick, Coburg, Germany | ||
Teflon filters | Pall | R2PJ46 | |
TEOM | Rupprecht & Patashnick NY, USA | series 1400 | |
Tissue culture flask | Thermo Fisher Scientific Inc. | 690175, 658175, 660175 | |
Transwell inserts | Corning | 3460, 3462 | |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25300 | |
Tryptan Blue | Sigma Aldrich | T8154 |