Y-27632 обогащает урожайность меланоцитов человека из тканей кожи взрослого человека
Summary
В этой статье сообщается, что добавление Y-27632 к среде TIVA может значительно увеличить урожайность меланоцитов из тканей взрослой кожи.
Abstract
Изоляция и культура первичных меланоцитов из тканей кожи очень важна для биологических исследований и широко используется для клинического применения. Изоляция первичных меланоцитов из тканей кожи обычным методом обычно занимает от 3 до 4 недель, чтобы пройти достаточно. Что еще более важно, ткани, используемые, как правило, новорожденных крайней плоти, и это все еще вызов, чтобы эффективно изолировать первичные меланоциты из взрослых тканей. Недавно мы разработали новый метод изоляции меланоцитов, который добавляет Y-27632, ингибитор орокиназы, к исходной среде культуры на 48 ч. По сравнению с обычным протоколом, этот новый метод резко увеличивает урожайность меланоцитов и сокращает время, необходимое для изоляции меланоцитов из тканей форечкина. Теперь мы подробно описываем этот новый метод с использованием эпидермиса для эффективной культуры первичных меланоцитов. Важно отметить, что мы показываем, что меланоциты, полученные из взрослых тканей, приготовленные этим новым методом, могут нормально функционировать. Этот новый протокол будет значительно пользу исследования дефектов пигментации и меланомы с использованием первичных меланоцитов, подготовленных из легко доступны взрослых тканей кожи.
Introduction
Целью данного исследования была разработка простого и эффективного протокола по изоляции меланоцитов от эпидермиса взрослой кожи для биологических исследований и клинических применений. Меланоциты, которые расположены в базальном эпидермисе кожи и волосяных фолликулов, играют важную роль в пигментации кожи и волос, производя меланин1. В результате пигментации кожи от эпидермальных меланоцитов действует как ультрафиолетовый фильтр излучения, который уменьшает / предотвращает повреждение ДНК для основных клеток в коже2. Аномальное распространение меланоцитов в коже довольно часто, например, при формировании доброкачественных неви (кротов), в которых меланоциты потенциально трансформируются в онкогенный рост с последующим клеточным сенесценцией3.
С 1957 года изоляция и последующая культура первичных меланоцитов человека была возможна4, но только с 1982 года существует эффективный метод, который может воспроизводить культуры человеческих меланоцитов из эпидермиса5. Обычный метод изоляции первичных меланоцитов от эпидермиса включает в себя двухступенчатое ферментативное пищеварение. Короче говоря, кожа первоначально усваивается с диспазом, чтобы отделить эпидермис от дермы, после чего эпидермис усваивается с трипсином для производства суспензий, содержащих меланоциты и кератиноциты, которые затем могут быть выборочно выращены в различных средствах массовой информации. В настоящее время начальная культура обычно занимает от 3 до 4 недель для меланоцитов для достижения слияния с использованием обычного метода, который, вероятно, из-за низкой эффективности их изоляции. Таким образом, увеличение первоначального производства меланоцитов из тканей взрослой кожи было бы весьма полезным как для лабораторных исследований и клинических применений.
Многие факторы роста, большинство из которых, как было показано, выделяются кератиноцитами (например, З-МЗ, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF и SCF)5–8, регулируют дифференциацию и распространение мелких меланоцитов млекопитающих. При отсутствии фидерных слоев, отсутствие этих факторов роста приводит к снижению пролиферации меланоцитов и их повышенного апоптоза9. Сокультура кератиноцитов в качестве фидерных клеток и меланоцитов может привести к ускорению пролиферации меланоцитов и снижению апоптоза. Тем не менее, метод совместной культуры не только требует больше тканей кожи для подготовки кератиноцитов, что не практично, но и не может работать эффективно, потому что культурные условия, требуемые меланоцитов не способствует росту кератиноцитов, и наоборот.
Предыдущие исследования сообщали, что добавление Y-27632, ингибитора ROCK, в среду роста может повысить выход первичных эпидермальных клеток человека из тканей кожи10–14. Поэтому было бы интересно проверить, выиграет ли изоляция первичных меланоцитов человека от присутствия Y-27632. Действительно, добавление Y-27632 в прививку TIVA среды15, которая содержит TPA, IBMX, Na3VO4 и dbcAMP, значительно увеличил урожайность первичных меланоцитов, изолированных от тканей предпышной кожи в начальных культурах16. По сравнению с обычным протоколом, этот новый протокол значительно более эффективен в увеличении урожайности меланоцитов16. Таким образом, этот протокол описывает новый метод подробно с использованием тканей кожи взрослых на основе предыдущего исследования16 в целях содействия его применению в основных и прикладных биологических исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, был основан на недавней публикации16. Особое внимание следует уделить следующим важнейшим шагам для достижения наилучших результатов с помощью нового метода. Во-первых, успешное разделение эпидермиса и дермы имеет решающее значение. Разрежьте тк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальной программой исследований и разработок Китая (2017YFA01016604), Общей программой Национального фонда естественных наук Китая (81772093), Проектом военно-логистических исследований (AWS17J005), Ключевой программой Фонда естественных наук провинции Шаньдун (ЗР2019 ) и Основные программы исследований и развития провинции Шаньдун (2019GSF108107) для X.W. Гуандун Основные и прикладные основные исследования фонда (2019A1515110833) и фундаментальные исследовательские фонды Шаньдунского университета (2019GN043) для J.M.
Materials
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA） | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
