Vi presenterar ett protokoll med hjälp av högupplösta mikro-datortomografi imaging att avgöra om spaceflight inducerad skador på okulär strukturer. Protokollet visar mikro-CT-härledda mätning av ex vivo gnagare okulär strukturer. Vi visar förmåga att bedöma okulär morfologiska förändringar efter spaceflight med hjälp av en icke-förstörande tridimensional teknik för att utvärdera okulär skador.
Rapporter visar att långvarig exponering för en rymdfärd miljö producerar morfologic och funktionella oftalmiska förändringar i astronauter under och efter en internationell rymdstation (ISS) uppdrag. De underliggande mekanismerna för dessa spaceflight-inducerade förändringar är dock för närvarande okända. Syftet med den föreliggande studien var att fastställa påverkan av spaceflight miljön på okulär strukturer genom att utvärdera tjockleken på musen näthinnan, retinal pigment epitel (RPE), den choroid och sclera lagret med hjälp av mikro-CT imaging. Tio veckor gamla C57BL/6 hanmöss var inrymt ombord på ISS för en 35-dagars uppdrag och sedan återvände till jorden levande för vävnad analys. Som jämförelse, markkontroll (GC) möss på jorden bibehölls i identiska miljöförhållanden och hårdvara. Okulära vävnadsprover samlades in för mikro-CT-analys inom 38(±4) timmar efter splashdown. Bilderna av tvärsnitt av näthinnan, RPE, den choroid och sclera lagret av den fasta ögat spelades in i en axiell och sagittal vy med hjälp av en mikro-CT imaging förvärv metod. Mikro-CT-analysen visade att tvärsnittsområdena i näthinnan, RPE och choroid skikttjockleken ändrades i spaceflight prover jämfört med GC, med rymdfärder prover visar betydligt tunnare tvärsnitt och lager jämfört med kontroller. Resultaten från denna studie visar att mikro-CT utvärdering är en känslig och tillförlitlig metod för att karakterisera okulär struktur förändringar. Dessa resultat förväntas förbättra förståelsen av miljöbelastningens inverkan på globala okulärstrukturer.
I mikrogravitationsmiljön hos rymdfärder kan ökat intrakraniellt tryck (ICP) som orsakas av vätskeförskjutning ha bidragit till rymdfärdsrelacierat neurookulärt syndrom (SANS)1,2,3,4,5. Faktum är att över 40% av astronauterna har upplevt SANS under och efter en internationell rymdstation (ISS) uppdrag6, inklusive rymdfärder föremål för NASA Twins Study7. Den nuvarande patofysiologi av SANS omfattar fysiologiska förändringar såsom optisk skiva ödem, globe flattening, choroidal och retinal veck, hyperopic brytning fel skift, och nerv fiber lager infarcts (dvs. bomull fläckar ull) och är väl dokumenterade5,8. De underliggande mekanismerna för de förändringar och faktorer som bidrar till skadeutvecklingen är dock oklara. För att få en bättre förståelse av SANS finns djurmodeller för att karakterisera de rymdfärdsrelaterade förändringarna i näthinnans struktur och funktion.
I en tidigare undersökning på samma djur, rapporterade vi effekterna av 35 dagars rymdfärder på mus näthinnan. Resultaten belyser att rymdfärder framkallar betydande skador i näthinnan och näthinnan vasculature, och vissa proteiner / vägar i samband med celldöd, inflammation och metabolisk stress ändrades avsevärt efterrymdfärder 9.
För närvarande finns det en mängd noninvasive imaging tekniker som fastställts för att övervaka sjukdomsutveckling och progression, samt fysiologiska reaktioner på olika miljö stressfaktorer, som också används i stor utsträckning i små gnagare modeller. En av dessa tekniker är mikro-CT, som utvärderar anatomiska strukturer och patologiska processer, och har framgångsrikt använts på organismer så små som möss10.
Micro-CT kan uppnå en microsized upplösning, och det kan ge hög kontrast för volymetrisk analys av mjuka vävnader med tillägg av lämplig kontrastmedel10,11,12,13,14. Mikro-CT-teknik är fördelaktig jämfört med traditionella metoder som bruttoanatomi, lättmikroskopi och histologiundersökning, eftersom den minimerar fysisk skada på exemplarens geometriska profil och inte förändrar det rumsliga förhållandet mellan strukturer. Dessutom kan tredimensionella (3D) modeller av strukturer rekonstrueras från mikro-CT bilder12,14. Hittills, trots bevis som visar synnedsättning efter exponering för rymdmiljön, få data i djurmodeller finns tillgängliga för en bättre förståelse av rymdfärder-associerade förändringar i näthinnans struktur och funktion. I den aktuella studien flögs möss på ett 35-dagars uppdrag ombord på ISS för att fastställa rymdfärdsmiljöns inverkan på okulär vävnadsstrukturer genom att kvantifiera mikrostrukturen i näthinnan, RPE och choroidlagren med hjälp av mikro-CT.
Resultaten av denna studie visade att det fanns strukturella förändringar i spaceflight musögat med hjälp av mikro-CT-tekniken jämfört med GC-grupper, särskilt av näthinnan, RPE, och choroid lagren av ögat, vilket framgår av deras minskade tjocklek. Micro-CT ger en effektiv och icke-förstörande teknik för att karakterisera förändringarna utan behov av manipulation. Användningen av PMA färgning förbättrade kvaliteten på mikro-CT bilder för att framgångsrikt få tydliga 3D-tomographic bilder efter återuppbyggnad, föregående något behov av att fysiskt ändra strukturen i exemplaret. En extra fördel med dessa bilder är att de visar hela regionen av intresse digitalt, och därigenom öka tillgängligheten samt reproducerbarhet av resultaten. Genom mikro-CT bilder som produceras under denna studie, visade riktade exemplar differentiering av flera strukturer som näthinnan, RPE, choroid och sclera skikt för bestämning av tjockleken på varje lager.
Ett kritiskt steg inom protokollet är manipuleringen av proverna på grund av deras storlek och konsistens. Hanteringen av preparatet måste göras noggrant utan att sätta press på preparatet under beredningen. Mikro-CT har vissa begränsningar: upplösning och bristen på standardiserade värden för parametrarna. Under skanningen kan de olika mikro-CT-skannrarna ha olika bildbehandlingsalgoritmer; ändå kalibrering för en gråskala kan eftersträvas för att övervinna alla problem. Efter skanning ska rekonstruktion av bilderna baseras på vävnaden och den analys som kommer att utföras. Det kan vara kritisk eftersom bildkvaliteten beror på det tomographic systemet, inställningarna, provexemplarstorleken samtberedningsmetoderna 16,17.
På grund av dess framgångsrika tillämpning i att studera flera typer av normala och patologiskt vävnader, mikro-CT imaging kapacitet bör användas i framtida forskning för att sammanställa volumetric data för andra analyser. Baserat på den aktuella studiens syfte var det således acceptabelt att använda måttmått av bidimensionell typ, men segmentering av 3D-bruttostrukturen kan också vara fördelaktigt att ge en exakt kontur av hela exemplaret. Även med alla fördelar med en icke-förstörande teknik, kommer mikro-CT inte ersätta andra metoder såsom immunohistokemi, men kommer att komplettera och tillåta efterföljande analyser histologi om så önskas.
En långvarig rymdfärder tillstånd producerar en rad strukturella och funktionella okulär förändringar i astronauterna under och efter rymduppdraget definieras som SANS. Resultaten inkluderar hyperopic skift, jordglob tillplattad, koroidal / retinal veck, och bomull fläckar19. I motsats till astronauternas optisk koherens tomografi (OCT) konstaterande av retinal nerv fiber skikt förtjockning, var gallring av näthinnan och choroidal lagret dokumenteras i denna djur mikro-CT studie. Dessa resultat var oväntade. Denna diskrepans kan bero på förvirrande faktorer. Möss har begränsad cephalad vätska skift jämfört med människa. Denna brist på vätskeskifte kan ha framkallat olika svar på gravitationella förändringar. För det andra, möss dissekerades inom 38 timmar efter splashdown, och ett akut svar för re-anpassning kan också bidra till morfologiska förändringar i näthinnan och choroid. Bekräftelse av denna möjlighet kräver ytterligare mätningar under rymdfärder och lång sikt efter uppdraget.
Resultaten av denna studie visar att rymdfärder, särskilt gravitationsförändringar, kan framkalla ett akut och kortvarigt svar i ögat. Ytterligare utredning behövs för att fastställa konsekvenserna av de akuta förändringar på okulär på näthinnefunktion och mekanism för rymdfärder–inducerad struktur förändringar.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NASA Space Biology grant # NNX15AB41G och LLU Institutionen för grundvetenskaper. Sungshin Choi, Dennis Leveson och Rebecca Klotz bidrog avsevärt till framgången för vår rymdfärdsstudie och vi uppskattar verkligen deras stöd. Författarna vill också tacka hela NASA Biospecimen Sharing Program grupp för deras stora hjälp.
Författarna vill också tacka Center for Dental Research för Micro-CT service.
10 wt. % phosphomolybdic | Sigma | 12026-57-2 | |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | |
X-ray micro-CT system SkyScan 1272 scanner | Bruker |