בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד
Summary
פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.
Abstract
שומן חום ו-בז ‘ הם ברקמות אדיפוז מיוחדות המודקות את האנרגיה לתרמוגנזה על ידי UCP1 (חלבון בלתי מצמד-1)-שבילים תלויים ועצמאיים. עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם תתי-סוגי מספר או תת אוכלוסיות נפרדות ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript. למרות ההתקדמות בגנומיקה תא יחיד, התפרקות לא משוחדת של רקמות האדיפוז לתוך סוגי התאים הסלולריים כבר מאתגרת בגלל האופי השברירי של adipocytes מלא השומנים. הפרוטוקול המוצג פותח כדי לעקוף מכשולים אלה על ידי בידוד אפקטיבי של גרעין יחיד מרקמת האדיפוז עבור יישומי במטה, כולל רצפי RNA. טרוגניות הסלולר ניתן לנתח על ידי רצפי RNA וניתוחים ביולוגיים.
Introduction
מחקרים הראו כי רקמת השומן החום (BAT) יש יכולת יוצאת דופן לפרוק אנרגיה. שני סוגים של adipocytes התרמוגניים עם תכונות התפתחותיות ברורים להתקיים הן מכרסמים ובני אדם: אדיפוציטים בז ‘ ו הקלאסי חום. בעוד adipocytes חום קלאסי ממוקמים בעיקר בתוך מחסני עטלפים העטלף, בצבע אדיפוציטים בז ‘ מופיע ברקמת השומן הלבן (WAT) בתגובה לרמזים פיסיולוגיים מסוימים, כגון חשיפה כרונית קר, תהליך המכונה “בראונינג” או “בייגינג”. באמצעות הדמיה מתקדמת, כעת ברור כי בני אדם בוגרים יש מחסני משמעותית של UCP1+ BAT, במיוחד באזור הגדול של1su, 1,2,3,4. כמות העטלף האנושי המבוגר מתואם בצורה מושלמת ויכול להיות מוגבר על ידי רמזים חיצוניים, כגון חשיפה כרונית לקור5,6 או β3-אדרררגיות קולטן אגוניסט7. ההוצאה האנרגטית של בת-תיווך עשויה להציע גישה מעשית ללוחמה בהשמנה.
עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים חשפו את קיומם של תת-סוגי או אוכלוסיות מרובות, כי הם ברורים ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript8,9,10. למשל, סוג של adipocyte בז ‘ כי מעדיפים בשימוש גלוקוז עבור התרמוגנזה, g-בז ‘ אדיפוציט, תיאר לאחרונה10. ההבנה הבלתי מלאה של סוגי התאים ברקמת השומן בחום ובבז ‘ והיעדר סמנים ספציפיים מהווים מכשול קריטי לחקר תפקודיו הביולוגיים.
שיטות מסורתיות לבידוד אוכלוסיות משנה של תאים מבוססות על ביטוי של רק כמה גנים הסמן הידוע. ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של תא בודד מאפשרת את השימוש בנתוני הביטוי הגנטי הגלובלי של תאים בודדים כדי לספק אומדן לא משוחדת של מספר אוכלוסיות המשנה ברקמה. המטרה האולטימטיבית של פרוטוקול זה היא לקבוע את כל סוגי הרקמה האדיפוז תחת גירויים תרמוגניים שונים ברזולוציה של תא בודד. בניגוד לרקמות אחרות וסוגי תאים, קביעת תת-סוגי תאית של רקמת האדיפוז מאתגרת עקב שבריאת האדיפוציטים מלאות השומנים. נייר זה מציג פרוטוקול חזק כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמת האדיפוז עבור יישום המטה לרצף snRNA. חשוב לעשות זאת, הספרות האחרונות השוואת התאמה היטב-גרעיני ברצף RNA (snRNA-seq) ו-תא יחיד ברצף RNA (scRNA-seq) datasets חשף כי snRNA-seq הוא המקבילה scRNA-seq בזיהוי סוג התא, ומעולה בכיסוי הסלולר עבור רקמה מורכבת כמו המוח11. פרוטוקול זה משלב מעבר הדרגתי צנטריפוגה שיטה ממוטבת עבור הרקמה האדיפוז על ידי רוזן ואח ‘12 עם גרעין “ניקוי” צעד עם מיון מהירות גבוהה של מופלו xdp. כפי שנראה תוצאות הנציג, ניתוח של 7,500 גרעיני יחיד מתוך העכבר רקמת שומן חום מזוהה מספר סוגי תאים בתוך adipocytes לכאורה חום הומוגנית. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט ויציב ניתן להחיל על המחקר ברמת רקמת הארגון של אדיפוציטים ותאים תושב אדיפוז, זיהוי של גנים סמן תת-סוג ספציפי, ופנוטיפים לפיתוח של אדיפוז-בררנית העכברים/טרנסגניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד גרעינים בודדים ולחקור את הטרוגניות רקמות מוצג. בהשוואה לרצף שלמות RNA רקמה, זרימת עבודה זו מציעה תצוגה משוחדת של טרוגניות הסלולר סמנים ספציפיים לאוכלוסיה. זה משמעותי וחדשני לקידום ביולוגיה adipocyte, חילוף חומרים מולקולרי, ומחקר השמנת יתר.
פרוטוקול זה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו רוצים להודות לדיויד ריינולדס מליבת אלברט איינשטיין גנומיקה ו Jinghang ג’אנג מן זרם Cy, ליבה לתמיכה טכנית. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (DK110426) ומענקי פיילוט והיתכנות מהמרכז לחקר הסוכרת של איינשטיין הר סיני (DK020541), ניו יורק מרכז מחקר השמנת יתר (DK026687) (כולם כדי K.S.). אנחנו גם רוצים להודות לאלברט איינשטיין סרטן המרכז (CA013330) לתמיכה בליבה.
Materials
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
