Den metylererte RNA immunforekomstanalysen er en antistoffbasert metode som brukes til å berike for metylert RNA-fragmenter. Kombinert med dyp sekvensering, fører det til identifisering av transkripsjoner som bærer m5C modifikasjon.
Sekundære basemodifikasjoner på RNA, for eksempel m5C, påvirker strukturen og funksjonen til de modifiserte RNA-molekylene. Metylert RNA Immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-seq) er en metode som tar sikte på å berike for metylert RNA og til slutt identifisere modifiserte transkripsjoner. Kort sagt, sonicated RNA inkuberes med et antistoff for 5-metylert cytosiner og utfelles ved hjelp av protein G perler. De berikede fragmentene blir deretter sekvensert, og de potensielle metyleringsstedene tilordnes basert på fordelingen av lysene og toppdeteksjonen. MeRIP kan brukes på enhver organisme, da det ikke krever noen tidligere sekvens eller endring av enzymkunnskap. I tillegg, i tillegg til fragmentering, blir RNA ikke utsatt for noen annen kjemisk eller temperaturbehandling. MeRIP-seq gir imidlertid ikke enkjerners forutsigelse av metyleringsstedet som andre metoder gjør, selv om det metylert området kan begrenses ned til noen få nukleotider. Bruken av ulike modifikasjonsspesifikke antistoffer gjør at MeRIP kan justeres for de forskjellige basemodifikasjonene som finnes på RNA, og utvider mulige anvendelser av denne metoden.
I alle tre levekårer gjennomgår RNA-arter etter transkripsjonsmodifikasjoner, og forskning på disse funksjonelt relevante biokjemiske modifikasjonene kalles “epitranscriptomics”. Epitranscriptomics er et voksende felt og ulike metoder utvikles for å studere og kartlegge modifikasjoner på RNA molekyler (gjennomgåtti 1,2). Mer enn hundre RNA modifikasjoner har blitt funnet, oppdaget i rRNAs, tRNAs, andre ncRNAs, samt mRNAs3,4. Selv om tilstedeværelsen og funksjonen til kjemisk varierte post-transkripsjonelle modifikasjoner i tRNAs og rRNAs er grundig studert5,6,7,8, bare nylig har mRNA modifikasjoner blitt karakterisert. I planter har mange mRNA modifikasjoner blitt identifisert til dags dato, inkludert m7G på hettenstruktur 9, m1A10, hm5C11,12, og uridylation13. Men bare m6A10,14,15, m5C11,16,17, og pseudouridine18 har blitt kartlagt transkripsjonome-wide i Arabidopsis. Post-transkripsjons mRNA base modifikasjoner er involvert i flere utviklingsprosesser19,20.
En av de mest brukte tilnærmingene i epitranscriptomics er den metylert RNA immunprecipitation kombinert med dyp sekvensering (MeRIP-seq). MeRIP-seq ble utviklet i 2012 for å studere m6A ipattedyrceller 21,22. Det krever bruk av et antistoff for ønsket modifikasjon og tar sikte på å berike for RNA fragmenter som bærer de modifiserte nukleotid(er). Det etterfølges vanligvis av dyp sekvensering for å identifisere og kartlegge de berikede fragmentene eller kvantitative PCR for å verifisere bestemte RNA-mål. Nøyaktigheten av MeRIP er basert på spesifisiteten av antistoffet for å gjenkjenne den modifiserte nukleotid over lignende modifikasjoner (f.eks m5C og hm5C11,23). Foruten m6A, MeRIP-seq har også blitt brukt til studie m1A og m5C RNA metylering i flere organismer11,17,23,24,25.
Metylering av cytosin ved femte karbonposisjon (m5C) er den mest utbredteDNA-modifikasjonen 26,27 og en av de vanligste RNA-modifikasjonene også3,4. Mens m5C ble oppdaget i eukaryotiske mRNAs i 197528, bare nylig har studier fokusert på å kartlegge modifikasjonen transkripsjon-wide, i koding og ikke-koding RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.
Alternative metoder som brukes i m5C RNA forskning inkluderer kjemisk konvertering av ikke-metylert cytosiner til uracils (bisulfite sekvensering) og immunforebygging analyser basert på en irreversibel binding av en kjent RNA cytosin metyltransferase til sine RNA mål (miCLIP, aza-IP). Kort sagt utnytter bisulfittsekvensering funksjonen til 5-metylert cytosin for å være resistent mot natriumbisulfittbehandling som deaminates umodifiserte cytosiner til uracil. Metoden ble først utviklet forDNA,men tilpasset for RNA også, og mange studier har valgt denne tilnærmingen til å oppdage m5C-steder i RNA16,23,29,32,34,35. Både miCLIP og aza-IP krever tidligere kunnskap om RNA cytosinmetyltransferase og bruk av det respektive antistoffet. Ved miCLIP (metylering individuell nukleotid-oppløsning krysskobling og immunoprecipitation), bærer metyltransferase en enkelt aminosyremutasjon slik at den binder seg til RNA-substratet, men kan ikke frigjøres30. I aza-IP (5-azacytidin-mediert RNA immunoprecipitation), den irreversible bindingen er dannet mellom 5-azaC nukleosid og RNA cytosin metyltransferase når eksogent gitt 5-azaC er innlemmet av RNA polymeraser i et mål RNAmolekyl 31.
Den største fordelen med disse tre metodene er at de tillater enkel nukleotid oppløsning kartlegging av m5C. I tillegg gir miCLIP og aza-IP informasjon om de spesifikke målene for en valgt RNA cytosinmetyltransferase, og dechiffrerer dypere mekanismen og rollen til posttranskripsjonelle RNA-modifikasjoner. MeRIP-seq-tilnærmingen kan imidlertid identifisere transkripsjonsområder m5C uten at noen forkunnskap er nødvendig og unngår tøffe kjemiske og temperaturforhold, for eksempel bisulfittbehandling eller inkubasjon med 5-azaC. Både MeRIP og bisulfittsekvensering kan hemmes av sekundære RNA-strukturer36. Fragmenteringstrinnet som inngår i MeRIP-analysen før immunforekomst tar sikte på å lette antistoffbindingen og øke oppløsningen av m5C-identifikasjon.
En annen metode verdt å nevne er massespektrometri (MS) av RNA-nukleosider. MS kan oppdage og skille alle typer modifikasjoner både på DNA og på RNA. Kort sagt, RNA er ekstrahert og DNase fordøyd, deretter desalted og fordøyd til enkelt nukleosider. RNA-nukleosider analyseres av et massespektrometer. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere nivåene av hver modifikasjon, og det er ikke avhengig av et antistoff eller en kjemisk konvertering. En stor ulempe er imidlertid at den gir masseinformasjon om tilstedeværelsen av RNA-modifikasjoner. For å kartlegge modifikasjonene må MS kombineres med RNase fordøyelse og sekvenseringsinformasjon om spesifikke RNA-molekyler, som i tilfelle av humant tRNALeu(CAA)37.
Her beskriver og diskuterer vi MeRIP-analysen som brukes til å studere m5C RNA-metylering i Arabidopsis17.
RNA har mer enn hundre forskjellige basemodifikasjoner4 som danner epitranscriptome44. Disse endringene legger til et ekstra lag med regulering av oversettelse og signalisering (gjennomgåtti 5,6,8,20,45,46). Tidlige studier var i stand til å oppdage tilstedeværelsen av post-transkripsjonelle modifikasjoner på RNA28,47, men de spesifikke modifiserte RNA-ene må identifiseres for å forstå epitranscriptomics rolle. MeRIP ble designet som en metode for å kartlegge RNA metylering nettsteder transkripsjon-wide21,22. Det kan tilpasses enhver modifikasjon, hvis et bestemt antistoff er tilgjengelig.
Hovedstyrken i denne protokollen er at det er relativt enkelt, trygt for RNA og brukeren (f.eks. 5-azaC er svært giftig for planter og mennesker) og krever ikke sekvens eller endring av enzyminformasjon. Videre øker berikelsen av metylert RNA-er av IP sjansene for at lave rike mRNAer oppdages, i motsetning til bisulfittsekvensering som ikke inneholder et berikelsestrinn. Når to serierunder med MeRIP utføres, øker berikelsen i RNA-fragmenter som inneholder metyleringsstederytterligere 22. En av begrensningene i MeRIP, spesielt når det brukes på mRNA metyleringsstudier, er den høye mengden RNA som kreves som inngang for analysen. Ribodepletion – eller poly(A) berikelse – trinnet vil redusere bakgrunnen forårsaket av tungt modifisert ribosomal RNA, men det fjerner mer enn 90% av totalt RNA. DNA må også fjernes helt da det er rikt på 5-metylert cytosiner. En annen ulempe er den lavere oppløsningen av den nøyaktige posisjonen til metylering. Sonikering av RNA før inkubasjon med antistoffet hjelper mot denne retningen ved å begrense regionen som inneholder modifikasjonen til 100-200 nukleotider. Når MeRIP kombineres med dyp sekvensering, øker oppløsningen av m5C-nettstedsforutsigelsen etter hvert som sekvenseringen leser danner en gaussisk fordeling rundt det potensielle metyleringsstedet. I tillegg må spesifisiteten av antistoffet bekreftes før analysen (f.eks. med RNA dot blot-analyser, utført med oligos syntetisert med modifiserte nukleotider), men i hvilken grad et antistoff faktisk kan skille mellom nært beslektede modifikasjoner (f.eks m6A og m6Am) er et argumentpunkt ifeltet 48,49. Videre kan svært strukturerte RNA forstyrre antistoff-antigeninteraksjonen, en annen begrensning som for det meste er adressert med fragmentering og denaturation av RNA før IP. Tvert imot, bisulfite sekvensering som også påvirkes av sekundære strukturer, inkluderer ikke et fragmenteringstrinn, og dette kan være en grunn til at det forårsaker avvik mellom m5C-områdene og mRNAs spådd av bisulfite sekvensering16 og MeRIP-seq11,17. Andre cytosinmodifikasjoner (f.eks. hm5C) er også motstandsdyktige mot bisulfittmediert deamination35.
Modifikasjoner av MeRIP-seq inkluderer et krysskoblingstrinn, enten med innføringen av en fotoaktiv ribonucleoside (foto-crosslinking-assistert m6A-seq, PA-m6A-seq 50) eller bruke UV-lys for å lage antistoff-RNA krysskoblinger etter IP (miCLIP49, annen metode enn miCLIP beskrevet iintroduksjonen 30, men også med individuell nukleotid oppløsning). I fremtiden, og som kunnskap om RNA metylering akkumuleres, mer målrettede tilnærminger kan være å foretrekke, basert på endrende enzymer og / eller konsensus sekvenser der metylering vises. Identifisering av leserproteiner er avgjørende for forståelsen av molekylær og signalfunksjonen til post-transkripsjonelle modifikasjoner. Nanopore sekvenseringsteknologi tillater allerede direkte identifisering av modifiserte nukleotider uten tidligere behandling av RNA17, men det er fortsatt rom for forbedring på dette feltet angående sekvensdybde og bioinformatisk analyse. Samlet sett er MeRIP-seq for tiden en etablert, pålitelig og objektiv tilnærming for å identifisere metylert RNA-transkripsjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et IMPRS PhD-stipend til E.S, et EMBO Long-Term Fellowship til V.P., og MPI-MPP interne midler til F.K. En del av dette arbeidet ble også finansiert gjennom PLAMORF, et prosjekt som har mottatt støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under Den europeiske unions Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram (Grant agreement No. 810131). Forfatterne vil gjerne takke Federico Apelt for den bioinformatiske analysen og kommentarene til manuskriptet, og Mathieu Bahin og Amira Kramdi for den bioinformatiske analysen.
α‐m5C antibody | ZymoResearch | A3001 (discontinued), A3002 available | Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available |
Chip and reagents for capillary electrophoresis | Agilent | 5067-1511 | RNA 6000 Nano kit |
Dnase | Ambion | AM1907 | TURBO DNA-free kit |
Co-precipitant of nucleic acids | Ambion | AM9515 | Glycoblue, 15 mg/mL |
In vitro transcription kit | Promega | P1300 | T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System |
Low-binding reaction tubes | Kisker Biotech | G017 | 1.7 ml microcentrifuge tubes |
Protein G magnetic beads | Invitrogen | 10003D | Dynabeads Protein G |
Proteinase K | Ambion | AM2546 | 20mg/mL stock solution, RNA grade |
RNase inhibitor | Promega | N2615 | RNasin Plus 40 U/μl |
rRNA removal kit | Epicentre | RZPL11016 | Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf) |
Sonication tubes | Covaris | 520045 | microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm |
RNA extraction reagent | Ambion | 15596018 | TRIzol reagent |
Equipment | |||
Capillary electrophoresis machine | Agilent | G2939BA | 2100 Bioanalyzer System |
Magnetic rack | Invitrogen | 12321D | DynaMag-2 |
Microentrifuge | Eppendorf | discontinued | 5417R model |
Rotator | Benchmark | R4040 | RotoBot Mini |
Sonicator | Covaris | 500217 | S220 Focused-ultrasonicator |
Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONEC-W | NanoDrop OneC |
Waterbath | GFL | 1012 | 1012 Incubation bath |