Summary
该方法可在无灰的基础上对软煤（即氧化和非氧化褐煤和次烟煤）、腐植酸盐矿石和页岩、泥炭、堆肥和商业肥料以及土壤改良剂的干燥和液体材料中的腐殖质物质（例如腐殖质和富里酸）进行重量法定量。
Abstract
该方法的目的是在软煤，腐殖矿石和页岩，泥炭，堆肥和含腐殖质物质的商业产品中提供准确和精确的腐殖酸（HA）和/或富里酸（FA）浓度。该方法基于碱性提取测试材料，使用0.1 N NaOH作为萃取剂，并通过离心从不溶性产物中分离碱性可溶性腐殖质（HS）。然后将离心碱性提取物的pH值调节至pH 1，并具有HCl浓度，从而导致HA的沉淀。通过离心将沉淀的HA与黄腐酰组分（FF）（留在溶液中的HS馏分）分离。然后将HA烘箱或冷冻干燥，并确定干燥的HA的灰分含量。然后将纯（即无灰）HA的重量除以样品的重量，并将所得分数乘以100以确定样品中的%HA。为了确定FA含量，将FF加载到疏水性DAX-8树脂上，该树脂吸附FA馏分也称为疏水性富里酸（HFA）。剩余的非富里酸级分，也称为亲水性富里酸级分（HyFF），然后用去离子H2 O洗涤树脂，直到所有非吸收材料完全除去。然后用0.1 N NaOH解吸FA。然后将所得的氟化钠通过使其通过强H +交换树脂进行质子化。所得FA在烘箱或冷冻干燥后，测定样品中的灰分含量和浓度，如上所述计算HA。
Introduction
腐殖质（HS）是微生物分解和转化死亡植物组织1，2，3通过称为湿润的过程增强微生物副产物和生物质3，4，5而产生的动态残留物6。HS存在于土壤、天然水域、湖泊沉积物、泥炭、软煤和腐殖质页岩中，估计占地球有机碳总量的25%7。这些物质是数千种独特分子的复杂混合物，这些分子根据其在强碱性和酸性水溶液中的不同溶解度被分馏成三个主要部分。这些馏分是腐植酸（HAs），其包含碱溶性但不溶于酸的馏分;富里酸（FAs），可溶于碱和酸的馏分;和腐殖质馏分，在所有pH值下均不溶6，8。黄腐酸级分（FF）进一步细分为疏水性FA（HFA）和亲水性（HyFA）级分。这些馏分被定义为FF中与疏水性DAX-8树脂（HFA）结合的部分和不与树脂结合的部分（HyFA）。
HS越来越多地用于农业，在那里它们被广泛用作作物生物刺激素，在畜牧业中，特别是作为牲畜饲料添加剂，在钻井泥浆中采矿，以及作为电子穿梭的环境修复。在人类医疗应用中使用HS的研究也在增加。
存在许多用于HA和FA定量的方法。但是，这些方法中的大多数既不准确也不精确。例如，在美国，两种最广泛使用的透明质酸测定方法是比色法9 和加州食品和农业部（CDFA）法，这两种方法都被证明高估了来自美国西部和加拿大的一系列矿石和提取物来源中的黑球酸含量10。比色法或分光光度法是不准确的，因为它依赖于碱性提取物的吸光度，除了HA之外，FA和其他发色团都以使用的波长吸收，并且标准品不代表被测材料10。CDFA方法不准确，因为它不能在无灰的基础上提供HA浓度。由于不同的矿石具有不同量的灰分，其中一些灰分随萃取而携带，并且萃取过程本身会添加灰分，因此该方法无法提供HA浓度的准确值10。为了满足对准确和精确方法的需求，2014年发布了基于by11 详细方法的标准化重量测量程序，以解决无灰基下HA和FA的定量问题12。然后，国际标准化组织（ISO）于2018年在肥料和土壤改良剂下对该方法进行了小幅修改，作为"肥料材料中腐殖质和疏水性富里酸浓度的测定"13。
本文概述了腐殖酸和疏水性黄腐酸的提取和定量方案，并详细介绍了该方法产生的数据的准确性和精确度。
Protocol
1. 固体样品制备
- 使用研钵和研杵压碎约5g待分析样品，使100%粉碎的样品通过尺寸为200号的美国标准筛网（即74μm），确保粉末充分混合。
- 通过重量法测定粉末的水份含量。
- 称量铝制称重船并记录质量（Wwb）。
- 将约2克样品粉末转移到称重艇中并记录质量（Wws + wb）。
- 将称重船置于102°C（不超过102°C）的干燥箱中24小时。24小时后，从干燥箱中取出称重舟，放入干燥器冷却至少1小时。
- 称重并记录称重船和干燥样品粉末的质量（Wds+wb）。
- 使用配方1.1确定水分含量。
式 1.1 固体样品粉末的水份含量
水分百分比 = （（（Wws+wb- Wwb） – （Wds+wb - Wwb））/ （Wws+wb - Wwb）） * 100
2. 提取程序
- 固体样品
- 将大约2.5克过筛的样品粉末（Wsamp）称入塑料或铝制称重船中，并将重量记录到小数点后四位。
- 将样品装入1 L量筒中，并用0.1 M NaOH（4 g NaOH x L-1）将样品填充至1 L。
- 加入磁性搅拌棒（例如，5 - 7厘米长）并在搅拌板上快速搅拌（即300 - 400 rpm），直到样品完全混合。
- 将量筒的全部内容物转移到1 L锥形瓶中，用N2 气体排空烧瓶的顶部空间，并用气密盖盖住烧瓶开口。
- 将锥形瓶放在搅拌盘上，以300 - 400 rpm的速度混合16 - 18小时。
- 液体样品
- 对于液体材料，通过振荡彻底混合样品，以确保测试液体均匀混合。确保任何可能落到容器底部的残留物都已彻底混合。
- 将约5g测试液体，称量至小数点后4位（WTL），加入1 L量筒中。
- 用0.1 M NaOH填充量筒，最终体积为1 L。
- 加入磁性搅拌棒（例如，5 - 7厘米长）并在搅拌板上快速搅拌（例如，300 - 400 rpm），直到测试样品完全混合。
- 将混合物转移到1 L锥形瓶中，用N2 气体排空顶部空间，并用气密盖盖住烧瓶开口。
- 将锥形瓶放在搅拌板上，以300 - 400 rpm混合1小时。
注意：在此之后，固体和液体样品的处理是相同的。
3. 从碱性提取物中去除不溶性物质
- 搅拌完成后，从搅拌板中取出烧瓶，将混合物转移到合适的离心管中，并以4，921× g 离心整个体积30分钟。
- 将含有HA和FA的碱性上清液收集在含有磁性搅拌棒的干净的1 L锥形瓶中。丢弃不溶性物质。如果离心后残留颗粒未沉淀，建议使用玻璃棉或定性2.5μm孔径滤纸过滤。
4. HA与FF的沉淀和分离
- 在搅拌板上以300 - 400rpm搅拌碱性提取物时，将pH探针插入溶液的中间部分（垂直），并将HCl滴加到碱性提取物中，直到达到pH 1.0±0.1的稳定pH值。
- 一旦达到pH 1的pH值并保持稳定，请从烧瓶中取出pH电极，取回搅拌棒，用气密盖住烧瓶，让烧瓶静置，直到沉淀的HA沉降到烧瓶底部。
注意：HA沉淀和退出溶液所需的时间将根据样品中HA的来源和量而有所不同。HA通常需要1-6小时才能完全沉淀并退出溶液。 - 离心提取物并以4921× g 沉淀HA1小时。离心后，将上清液FF倒入干净的1 L锥形瓶中，并用气密盖盖住。
注意：可能需要更长的离心时间，以便将透明质酸包装得足够牢固，以便在不包含任何沉淀的透明质酸的情况下倾析FF。 - 将离心管置于100°C的干燥箱中24小时。
- 干燥后，从干燥箱中取出管子，放入干燥器中冷却至室温。冷却后，用刮刀从管的侧面和底部刮取残留物，定量地从管中转移残留物，转移到焦油称重船上，并记录质量（WEHA）。这种残留物就是"提取的HA"。
注意：如果在分离HA和FF时使用了大于50 mL的离心管，则将沉淀的HA转移到耐高温的50 mL离心管中用于干燥过程是很方便的。此外，如果冷冻干燥机可用，沉淀的HA可以冷冻干燥。在冻干状态下收集透明质酸更容易，因为透明质酸不会粘附在塑料管的侧面，也不必报废。
5. 灰分含量的测定
注：测定干燥的HA和FA样品的灰分含量的程序是相同的。图中显示了对 HA 使用符号的过程。
- 将约30mg干燥的HA（WHA）转移到清洁，预先称量的陶瓷皿（WCD）中，该陶瓷盘先前已在100°C的干燥箱中干燥，然后在干燥器中冷却至室温。记录加权HA和培养皿（WHA + CD）的总质量后，在600°C下在马弗炉中燃烧HA2小时。
注：对于每个透明质酸样品，应处理三次重复，并在计算纯透明质酸时使用平均灰分含量。 - 2小时后，从马弗炉中取出盘子和内容物，放入干燥器冷却。冷却后，用灰分（WASH + CD）称量盘子，并使用公式1.2计算灰分比（Ashrat）：
公式 1.2 Ashrat = （WASH+CD - WCD） / （WHA+CD - WCD）
6. 纯化提取的HA的百分比的测定
- 通过使用公式1.3校正灰分含量来确定纯HA（WPHA）的最终质量：
公式 1.3 WPHA = WEHA * （1- 阿什拉特）
7. 测定原源样品中纯透明质酸的浓度（%）
- 使用式1.4和1.5测定纯HA的浓度：
式 1.4：固体样品中纯 HA 的百分比 = （WPHA/Wsamp） * 100
式 1.5：液体样品中纯 HA 的百分比 = （WPHA/WTL） * 100
8. 用于氢氟烷烃纯化的色谱柱制备
- 准备装有聚甲基丙烯酸甲酯DAX-8树脂的低压色谱柱。如果以前没有使用过树脂，请将树脂浸泡在甲醇中2小时，然后用去离子的H2 O彻底冲洗，直到所有甲醇都被除去。
- 此时去除漂浮在水面上的树脂小颗粒。如果以前使用过树脂，请按照第10节所述再生。
- 彻底冲洗后，将树脂倒入装有10μm色釉的端件的5 x 25 cm玻璃色谱柱中，用于树脂床支撑。在柱顶部留出2.5至5厘米的无树脂溶液，以便在进入树脂床之前使FF混合。将顶部安装到色谱柱上，并使用蠕动泵将去离子的 H2O 泵入色谱柱顶部，以包装 DAX-8 树脂床。
9. 氢氟烷烃的分离
- 树脂床填充后，使用蠕动泵在低压下通过塔的顶部将FF装载到塔上。使用 35 – 40 毫升/分钟的流速。在整个装载和漂洗过程中，色谱柱中树脂的顶部必须保持溶液覆盖，以防止树脂干燥和提取物通过树脂床的窜流，这一点至关重要。
- 一旦黄腐酸馏分完全加载到树脂上，用去离子水洗涤树脂，通过在低压下蠕动泵将其泵入柱顶部来除去非吸附的"亲水性富里酸馏分"（HyFF）。使用 35 – 40 毫升/分钟的流速。丢弃含HyFF的废水，除非将其用于分析。
- 用去离子的H2 O洗涤色谱柱，直到色谱柱流出物350nm处的吸光度等于（例如，在0.015吸光度单位内）与用于洗涤色谱柱的去离子H2O的吸光度相等。使用去离子水将分光光度计归零（即空白）。
- 使用蠕动泵通过柱底部泵送0.1 M NaOH，通过反向洗脱来解吸HFA。使用 35 – 40 毫升/分钟的流速。捕获泵的废水（在干净、足够大小的容器（例如，2 L Erlenmeyer）中捕获氮化钠。
注意：大多数 HFA 吸附在 DAX-8 树脂床的最顶部。通过从色谱柱底部引入0.1 M NaOH进行解吸，可最大限度地减少完全解吸FA所需的0.1 M NaOH量。 - 当柱流出物的吸光度等于350 nm处0.1 M NaOH进水的吸光度时，所有HFA均已解吸。使用0.1 M NaOH作为分光光度法空白。添加出水以检查解吸FA溶液的吸光度，以确保捕获所有FA。
10. 质子化氢化氢化合物脱灰
- 通过黄芷酸钠溶液，通过重力进料反复，通过5×50厘米柱中含有的强阳离子H +-交换树脂（材料表），用玻璃釉保留树脂，直到流出物的电导率<120μS / cm，如电导率仪测量的那样。在每次通过之前，H+-交换树脂需要按照第11节所述进行翻新。
- 为确保在最后一次通过后从树脂中除去所有FA，请用去离子水洗涤树脂，直到350nm处流出物的吸光度与用于洗涤色谱柱的去离子水相同（例如，在0.015吸光度单位内）。使用去离子的H2O作为分光光度法空白。加入洗涤物和任何出水部分，以检查纯化的FA溶液的吸光度。为了帮助去除所有FA，树脂可以被搅拌多次（例如，使用长玻璃或塑料棒）。
- 通过使用旋转蒸发器在55°C下将FA浓缩至约15±2 mL的体积。
- 将15 mL FA浓缩物完全转移到50 mL塑料离心管中，并在60±3°C下干燥，在干燥箱中保持恒定干燥。冷冻干燥是烘箱干燥的替代方案。干燥后，将管子转移到干燥器中冷却。
- 用刮刀刮擦管的侧面和底部，将收集的FA在预去皮的称量纸上称量，从管中取出FA。这种材料是"提取的FA"（WEFA）。
- 按照 HA 的步骤 6 中所述确定提取的 FA 的灰分比 （ASHrat），并使用公式 1.2 计算灰分比。使用公式1.3确定提取的无灰FA（WPFA）的重量，用WEFA代替WEHA的重量。最后，使用配方1.4代替WPFA测定样品中的纯FA百分比。
11. DAX-8树脂再生
- 通过泵送0.1 M HCl（8.33 mL浓缩HCl / 1000 mL最终体积去离子H2O）通过柱底部，直到流出物的pH等于进料的pH，来再生DAX-8树脂。在再生过程中，使用蠕动泵将所有试剂泵送至 DAX-8 色谱柱。
- 通过将去离子水泵入色谱柱顶部，直到流出物的pH值等于进水的pH值（即去离子水），用去离子水冲洗色谱柱。
12. H+-阳离子交换树脂再生
- 通过将树脂倒入大型烧杯（例如，4 L塑料烧杯）中，在间歇工艺中再生H + 阳离子交换树脂，用DI H2O覆盖树脂冲洗几次，混合然后倒出水。
- 用 1 M HCl（83.3 mL 浓缩 HCl/1000 mL 最终体积 DI 水）覆盖树脂。静置至少2小时，偶尔搅拌（例如，每30分钟一次）。
- 通过倒掉酸并用DI水覆盖树脂来去除树脂中的多余酸。用搅拌棒剧烈搅拌15秒，然后让树脂落到烧瓶底部，然后倒出水。重复该过程，直到冲洗水的电导率≤0.7μS / cm。
- 将再生树脂装回色谱柱中。用去离子的H2O覆盖，以确保树脂在两次使用之间保持湿润。
Representative Results
表 1 – 5 中提供了该方法的性能数据。表1给出了从HA和FHA浓度非常不同的液体商业样品中提取HA和FAH的方法的精度。
HA的相对标准差（RSD）低于HFA，但三个液体样品的平均HFA RSD为6.83%，这表明其精度很高。Horwitz比率（HorRat）是一个归一化的性能参数，表示分析方法在实验室精度范围内的适用性。在这里，它被用于实验室内的精确度。值<0.5可能表示未公开的平均值或对该方法的高水平经验。> 2.0的值表示测试样品的异质性，需要方法优化或更广泛的训练，低于检测限或方法不适用。对于液体样品的分析，HorRat仅在其中一项HFA分析中>2（表1）。
表 2给出了从三个腐殖质矿石样品中提取HA和HFA的精确数据。同样，除了从矿石2中提取的HFA和从矿石3中提取的HA之外，所有HorRat都低于2。这表明该方法在腐殖质矿石样品中提取HA和HFA方面具有高度的精确性。
植物生物刺激素的制造商通常配制的产品除了海藻，无机肥料，煤或糖蜜等其他成分外，还含有HS。表3给出了对方法精度上这些类型添加剂的掺入的分析结果。没有一种添加剂对透明质酸或氢氟烷烃的回收有显著影响（表3）。
表4 和 表5 分别报告了模拟极低浓度商业产品的液体样品中HA和HFA的回收率。HA的回收率在88%至97%之间（表4）和HFA的92%至104%之间（表5）。HA和HFA的平均回收率分别为93%和97%，两种HS的RSD百分比均低于5%。虽然精度非常好，但这些数据表明需要进行实验室复制。HA的方法检测限（MDL）和方法定量限分别为4.62和1.47 mg/L，HFA为4.8和1.53 mg/L。
| 腐殖质， % | |||||||
| 材料 | L16型 | L17型 | 二层 | ||||
| 氢氟烷烃 | 医 管 局 | 氢氟烷烃 | 医 管 局 | 氢氟烷烃 | 医 管 局 | ||
| 代表 1 | 1.44 | 17 | 6.59 | 7.76 | 0.36 | 4.46 | |
| 代表 2 | 1.39 | 16.03 | 6.25 | 7.79 | 0.42 | 4.93 | |
| 代表 3 | 1.34 | 16.44 | 6.02 | 7.55 | 0.4 | 4.46 | |
| 代表 4 | 1.54 | 16.75 | 6.2 | 7.69 | 0.33 | 4.53 | |
| 意味 着 | 1.43 | 16.56 | 6.27 | 7.7 | 0.38 | 4.6 | |
| 标清 | 0.09 | 0.42 | 0 | 0.11 | 0.04 | 0.23 | |
| 24 | |||||||
| RSD， % | 6.29 | 2.53 | 3.8 | 1.39 | 10.4 | 4.91 | |
| 贺鼠（r） | 1.58 | 0.72 | 1.25 | 0.47 | 2.31 | 1.55 | |
| 一个提取条件为1 g in 1 L 0.1 M NaOH。 | |||||||
表 1.从液体商业样品中提取和定量HA和HFA的方法的精确性。 提取条件为1 g in 1 L 0.1 M NaOH。
| 腐殖质， % | ||||||
| 矿石 1 | 矿石 2 | 矿石 3 | ||||
| 材料 | 氢氟烷烃 | 医 管 局 | 氢氟烷烃 | 医 管 局 | 氢氟烷烃 | 医 管 局 |
| 代表 1 | 1.75 | 67.4 | 1.31 | 27.01 | 1.55 | 8.95 |
| 代表 2 | 1.69 | 67.63 | 1.25 | 27.48 | 1.41 | 7.2 |
| 代表 3 | 1.63 | 67.1 | 1.27 | 27.34 | 1.47 | 8.35 |
| 代表 4 | 1.77 | 67.59 | 1.55 | 26.89 | 1.51 | 7.98 |
| 意味 着 | 1.71 | 67.53 | 1.35 | 27.18 | 1.49 | 8.12 |
| 标清 | 0.06 | 0.94 | 0.14 | 0.28 | 0.06 | 0.73 |
| RSD， % | 3.7 | 1.39 | 10.33 | 1.02 | 4.02 | 9.02 |
| 霍拉特（r） | 0.99 | 0.66 | 2.71 | 0.42 | 1.07 | 3.09 |
表 2.从腐殖质矿石中提取和定量HA和HFA的方法的精确度。 提取条件为1 g样品在1 L 0.1 M NaOH中。（数据摘自Lamar等人，2014年）
| 复制 | 掺杂物 | 公顷， % | 足总， % | 相对回收 HA， % | 相对回收 HFA， % |
| 1 | 没有 | 81.61 | 12.86 | ||
| 2 | 没有 | 80.16 | 12.78 | ||
| 1 | 海藻 | 80.21 | 12.85 | ||
| 2 | 海藻 | 80.72 | 12.79 | 99.5 | 99.6 |
| 1 | 肥料 | 80.25 | 12.98 | ||
| 2 | 肥料 | 79.57 | 123.77 | 98.8 | 101.6 |
| 1 | 煤 | 78.79 | 12.92 | ||
| 2 | 煤 | 81.27 | 12.84 | 98.9 | 101.8 |
| 1 | 糖蜜 | 79.38 | 12.99 | ||
| 2 | 糖蜜 | 81.02 | 12.72 | 99.2 | 100.9 |
| 意味 着 | 80.3 | 12.85 | |||
| 标清 | 0.885 | 0.09 | |||
| a 最终浓度为2.5克/升的FA+HA加入0.1 M NaOH。（数据摘自Lamar等人，2015年） | |||||
表 3.掺假剂对加斯科因莱昂纳铁矿中HA和HFA定量的影响。 （数据摘自Lamar等人，2015年）
| 医 管 局 | |||
| 示例标识 | 提取，毫克 | 恢复，毫克 | 已恢复，% |
| 1 | 24.6 | 23.7 | 96.3 |
| 2 | 22.6 | 19.9 | 88.1 |
| 3 | 25.2 | 23.6 | 93.7 |
| 4 | 22.5 | 21.5 | 95.6 |
| 5 | 23.9 | 21.8 | 91.2 |
| 6 | 23.2 | 20.8 | 89.7 |
| 7 | 24 | 23.2 | 96.7 |
| 意味 着 | 23.7 | 22.1 | 93 |
| 标清 | 1.01 | 1.52 | 3.43 |
| RSD， % | 4.35 | 6.88 | 3.67 |
| （数据摘自Lamar等人，2014年） | |||
表 4.从尖峰空白中恢复 HA。 （数据摘自Lamar等人，2014年）
| 发 | |||
| 示例标识 | 提取，毫克 | 恢复，毫克 | 已恢复，% |
| 1 | 19.9 | 19 | 95.48 |
| 2 | 23.1 | 22.9 | 99.13 |
| 3 | 20.7 | 19.4 | 93.72 |
| 4 | 20.5 | 19.8 | 96.39 |
| 5 | 20.8 | 21.6 | 103.85 |
| 6 | 21.9 | 20.1 | 91.78 |
| 7 | 22.7 | 22.3 | 98.24 |
| 意味 着 | 21.37 | 20.73 | 96.94 |
| 标清 | 1.21 | 1.53 | 3.95 |
| RSD， % | 5.64 | 7.36 | 4.07 |
| （数据摘自Lamar等人，2014年） | |||
表 5.从尖峰空白中恢复氢氟烷烃。 （数据摘自Lamar等人，2014年）
Discussion
该方法中HA的提取和分离的初始步骤相对简单。由于HFA的分离涉及柱层析，因此获得可重复的结果需要严格遵守每个步骤和实践的细节。特别是，正确制备树脂至关重要。正确制备和包装聚甲基丙烯酸甲酯 DAX-8 树脂非常重要。树脂的正确包装会影响HFA的产量和质量。如果存在窜导，则预处理（即酸化）或HFA的吸附都不会完成，分离将导致不准确的结果。如果在样品上样之前观察到树脂中的通道或空间，则应移除并摇动色谱柱以重新分配树脂珠，让它们在没有通道的情况下沉降，然后通过泵送干净的DI H2 O通过树脂重新包装。此外，如协议所述，在将FF加载到树脂上时，保持树脂上方的液体体积将允许FF在进入树脂之前混合并导致更有效的吸附。对于强阳离子H+交换树脂（物料表），不能急于完全再生。Na + / H + 交换需要时间，因此最好在批量处理中完成，以便树脂可以在重新酸化的同时混合。在用 DI H2 O 冲洗时混合树脂有助于去除多余的 HCl。当升温酸化树脂以除去多余的酸时，混合树脂有助于除去HCl。将酸去除到电导率为0.7μS /cm≤点非常重要。否则，HCl将与HFA一起结转。
最后，当从DAX-8树脂中解吸HFA时，一旦进水的吸光度等于流出物的吸光度，最好让色谱柱静置几个小时，看看是否会释放出任何额外的HFA。如果是这样，它将被视为树脂上方液体的黄变。如果发生这种情况，可以通过继续解吸去除额外的HFA，直到进水/流出物的吸光度再次相等。
HFA 隔离的缺点之一是整个过程非常耗时。从DAX-8树脂中完全解吸HFA和从H +交换树脂中完全去除都会导致大量的HFA，必须通过旋转蒸发来减少。这绝对是分析中的瓶颈。为了减少这一时间，建议使用丙酮而不是0.1 M NaOH从DAX-8树脂中解吸HFA14。作者声称，通过使用50%丙酮作为脱水剂代替NaOH，获得了类似的HFA结果，并且DAX-8被充分再生，因此可以消除H +交换步骤。与水相比，这种改性大大减少了丙酮的体积和更快的旋转蒸发，从而大大缩短了分析时间。这种修改值得进一步研究。
该方法仅限于对经过腐殖化过程的有机物的分析，对于泥炭和软煤，分别是泥炭化和泥炭化和煤化的进一步过程。腐殖化是一种过程，其中死亡的，主要是植物材料，被一系列微生物分解，这些微生物消耗和修饰越来越顽固的底物。非生物过程也参与分解和再合成反应。腐化最终导致相对顽固的材料的产生，这些材料由数千个分子的异质混合物组成，这些分子形成一系列分子量和形成HS的碳，氧和氢含量。HS通过泥炭化和煤化进一步改性。因此，这种方法不适用于经过化学过程改性的植物材料。例如，木质素磺酸盐被广泛用作HFA掺假药。木质素磺酸盐是亚硫酸盐制浆工艺的副产品。因此，这种材料不是通过腐殖化过程生产的。此外，还有许多物质与DAX-8树脂结合。例如，DAX-8树脂已被用于从溶液中吸附农药15。显然，杀虫剂不是HS。因此，材料与DAX-8树脂的结合并不能证明它是HFA的说法是合理的。先决条件是通过腐殖化和与DAX-8树脂结合来生产。
随着对HS的各种组分在不同应用中的贡献有了更多的了解，进一步分馏HS并可能成为有利的，从而相应地修改了方法。就目前而言，该方法无法量化HYFA。然而，该组分也可能具有活性，例如在植物生物刺激中，其中整个FF通常应用于农业处理而不是纯化的HFA。
Disclosures
作者没有利益冲突要声明。
Acknowledgments
作者要感谢腐殖质产品贸易协会（HPTA）在资助本文中描述的方法标准化的工作方面的支持，以及Lawrence Mayhew和Dan Olk博士以及Paul Bloom博士在标准化工作期间提供的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amberlite IR 120 H+-exchange resin | Sigma-Aldrich | 10322 | H+ form |
| Analytical Balance | Ohaus | PA214 | w/ glass draft shield |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14 | minimum 4300 rpm |
| Centrifuge tubes | Beckman Coulter | To fit rotor selected | |
| Ceramic Combustion Crucibles | Sigma | Z247103 | |
| Chromatography column for DAX-8 | Diba | Omnifit 006EZ-50-25-FF | |
| Chromatography column for IR 120 | Chemglass | CG-1187-21 2 in. by 24 in. | |
| Dessicator | Capitol Scientic | Kimax 21200-250 | Vacuum type |
| Drying Oven | Fisher Scientific | Isotemp | Precision±3?C |
| Electrical conductivity meter | HM Digital | EC-3 | |
| Erlenmeyer Flasks | Amazon | 1L, 2L | |
| HCl concentrated | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Magnetic Stir Plate | Barnstead-Thermolyne | Dataplate 721 | |
| Magnetic Stir bars | These can be obtained at many outlets | ||
| Muffle Furnace | Fisher scientific | Thermolyne Type 47900 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Nitrogen gas | Praxair | UNI1066 | 99.99% purity |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | Masterflex 7518-00 | |
| Perstaltic tubing | Cole Parmer | Masterflex Pharmed 06508-17 | |
| pH meter | Oakton Instruments | WD-35618--03 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-210/R-215 | |
| Spectrophotometer | Healthcare SCiences | Ultrospec II | Dual beam 200 to 900 nm with wavelength accuracy of ±1 nm and reproducibility of ±0.5 nm. |
References
- DiDonato, N., Chen, H., Waggoner, D., Hatcher, P. G. Potential origin and formation for molecular components of humic acids in soils. Geochimica et Cosmochimica Acta. 178, 210-222 (2016).
- Waggoner, D. C., Chen, H., Willoughby, A. S., Hatcher, P. G. Formation of black carbon-like and alicyclic aliphatic compounds by hydroxyl radical initiated degradation of lignin. Organic Geochemistry. 82, 69-76 (2015).
- Baldock, J. A., Skjemstad, J. O. Role of the soil matrix and minerals in protecting natural organic materials against biological attack. Organic Geochemistry. 31 (7-8), 697-710 (2015).
- Kallenbach, C. M., Frey, S. D., Grandy, A. S. Direct evidence for microbial-derived soil organic matter formation and its ecophysiological controls. Nature Communications. 7, 13630 (2016).
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