यह विधि कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस नमूनों और बाद में सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन से उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है।
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अक्सर सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन विधियों का उपयोग किया जाता है। परिकल्पना प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पुष्टि या नए लोगों की पहचान ब्याज के प्रोटीन के कार्य के बारे में अमूल्य जानकारी प्रदान कर सकती है। तैयारी निकालने के लिए पारंपरिक तरीकों में से कुछ अक्सर श्रम-गहन और समय लेने वाली तकनीकों की आवश्यकता होती है। यहां, एक संशोधित निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल एक मनका मिल होमोजेनाइजर और धातु मोतियों का उपयोग कर पारंपरिक प्रोटीन तैयार करने के तरीकों के लिए एक तेजी से विकल्प के रूप में वर्णित है । यह निकालने की तैयारी विधि डाउनस्ट्रीम सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन अध्ययनों के साथ संगत है। एक उदाहरण के रूप में, विधि का उपयोग सी एलिगेंस माइक्रोआर्पॉन्स माइक्रोआर्पॉन्ट एएलजी-1 और दो ज्ञात एएलजी-1 इंटरेक्टर्स: AIN-1, और HRPK-1 को सफलतापूर्वक सह-इम्यूनोप्रिपिपेट करने के लिए किया गया था। इस प्रोटोकॉल में पशु नमूना संग्रह, निकालने की तैयारी, स्पष्टीकरण निकालने और प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन का विवरण शामिल है। वर्णित प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किसी भी दो या अधिक अंतर्जात, अंतर्जात टैग, या अतिव्यक्त सी एलिगेंस प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
ब्याज के प्रोटीन के मैक्रोमॉलिकुलर इंटरैक्शन की पहचान करना इसके कार्य के बारे में अधिक सीखने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। इम्यूनोप्रिपिपिटेशन और सह-इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रयोगों का उपयोग बड़े पैमाने पर प्रोटेओमिक दृष्टिकोण1 के माध्यम से प्रोटीन के पूरे इंटरटक्टोम की पहचान करने या विशेष रूप से एक प्रोटीन की एक परिकल्पना इंटरैक्टेटर के साथ सहप्रेषण करने की क्षमता का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। सी एलिगेंसमें, विभिन्न प्रकार के प्रोटीन की गतिविधि के बारे में अधिक जानने के लिए दोनों तरीकों को सफलतापूर्वक नियोजित किया गयाहै, जिनमें जीन अभिव्यक्ति2,3,4को विनियमित करने के लिए माइक्रोआरएनए के साथ बारीकी से कार्य करने वाले लोग शामिल हैं। सह-इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रयोगों को अपने मूल सेलुलर वातावरण में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का परीक्षण करने का लाभ होता है, लेकिन निकालने की तैयारी चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली हो सकती है। नमूने का कुशल लाइसिस आवश्यक है, लेकिन प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के व्यवधान को कम करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। सी एलिगेंस टोटल प्रोटीन अर्क को सफलतापूर्वक तैयार करने के लिए5,सोनिकेशन6,बाल्च समरूपता7,और जिरकोनिया मोतियों-समरूपीकरण8,9 जैसे तरीकों का उपयोग किया गया है। इन तरीकों, जिरकोनिया मनका समरूपता के अपवाद के साथ, नमूनों की संख्या के संदर्भ में सीमाएं हैं जिन्हें एक साथ संसाधित किया जा सकता है। प्रस्तुत एक वैकल्पिक विधि है जिसे आसानी से उच्च-थ्रूपुट, सी एलिगेंस नमूनों से तेजी से प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसके बाद सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन होताहै। विशेष रूप से, विधि एक समय में 24 नमूने तैयार कर सकती है, जो एक्सट्रैक्ट तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम कर सकती है। इसके विपरीत, उदाहरण के लिए, douncing आम तौर पर एक समय में केवल एक नमूना तैयारी के लिए अनुमति देता है । इस निकालने की विधि का उपयोग सी एलिगेंसके किसी भी विकासात्मक चरण से अर्क तैयार करने के लिए किया जा सकता है।
वर्णित पशु नमूना संग्रह, निकालने की तैयारी, इम्यूनोप्रिपिटेशन, और पश्चिमी ब्लॉटिंग डेटा की प्रस्तुति के लिए एक कदम-दर-कदम प्रक्रिया है ताकि सफल प्रोटीन पुलडाउन और ब्याज के सह-इम्यूनोप्रिपिटिंग प्रोटीन का पता लगाने की पुष्टि की जा सके। प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए, 1) माइक्रोआरएनए आर्गोन्यूट एएलजी-1 और एईएनएन-1, एक GW182 होमोलॉग के बीच दो सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रयोग किए गए; और 2) एएलजी-1 और एचआरपीके-1, एक नव पहचाने गए एएलजी-1 इंटरएक्टिव2। एएलजी-1 और एइन-1 कोर प्रोटीन हैं जिनमें माइक्रोआरएनए-प्रेरित सिलिंग कॉम्प्लेक्स (miRISC) शामिल है और इन दो प्रोटीनों के बीच बातचीत अच्छी तरह से10, 11स्थापितहै। एक्सट्रैक्ट तैयार करने का प्रोटोकॉल एएलजी-1-एआईएन-1 सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रयोग में प्रभावी था। इस प्रोटोकॉल ने एएलजी-1 और इसके नए पहचाने गए इंटरएक्टिवेटर एचआरपीके-12के बीच बातचीत की सफलतापूर्वक पुष्टि की ।
संक्षेप में, पांडुलिपि एक सी एलिगेंस एक्सट्रैक्ट तैयारी प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जिसे सह-इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रोटोकॉल के साथ 24 नमूनों को एक साथ संसाधित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है जिसका उपयोग प्रोटीन के बीच नए या परिकल्पना बातचीत की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। निकालने की तैयारी प्रोटोकॉल कई डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ संगत है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन2 और माइक्रोआरएनए पुलडाउन12शामिल हैं। इसके अलावा, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किसी भी दो या अधिक अंतर्जात, अंतर्जात टैग, या अतिउच्च सी एलिगेंस प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
C. elegans सेल, आणविक, और विकासात्मक जीव विज्ञान19में बुनियादी सवालों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । एक आनुवंशिक मॉडल प्रणाली के रूप में अपनी शक्ति के अलावा, सी एलिगेंस जैव रासायनिक दृष्टिकोणों के लिए उत्तरदायी है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिटेशन और सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन प्रयोगों का संचालन करते समय एक संभावित बाधा ब्याज के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की कमी है। यदि कोई एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो कस्टम पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पन्न की जा सकती है। हालांकि, जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में हाल ही में नवाचारों ने शोधकर्ताओं को तेजी से उत्परिवर्तन या टैग अंतर्जात सी एलिगेंस जीन20,21को लागू करनेकीअनुमति दी है, जो जीन और एन्कोडेड प्रोटीन के बीच आनुवंशिक, कार्यात्मक और शारीरिक बातचीत को जानने वाले अध्ययनों को सुविधाजनक बनाता है । विशेष रूप से, CRISPR/Cas9-अंतर्जात loci पर सी elegans जीन की मध्यस्थता टैगिंग एंटीबॉडी उपलब्धता पर इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रयोगों की निर्भरता कम हो गई है, सह इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रयोगों को और अधिक व्यवहार्य बना रही है । सी एलिगेंस जीन को विभिन्न प्रकार के टैग के साथ टैग किया जा सकता है, जैसे कि जीएफपी या एमएचरी जैसे फ्लोरोसेंट टैग से लेकर फ्लैग और एचए जैसे छोटे टैग तक। इन टैगों को पहचानने वाले एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से आसानी से उपलब्ध हैं, जो इम्यूनोप्रिपिपिटेशन दृष्टिकोण के माध्यम से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के अध्ययन को सुविधाजनक बनाते हैं।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल, चित्रा 1में उल्लिखित, नमूनों की एक छोटी संख्या के लिए किया जा सकता है या ऊपर पहुंचा, एक समय में 24 नमूना तैयारी के लिए अनुमति देता है । जबकि इम्यूनोप्रिपिcipitation के माध्यम से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रारंभिक लक्षण आम तौर पर सामान्य बढ़ती परिस्थितियों में जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में किया जाता है, अनुवर्ती अध्ययन अक्सर आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म में या विभिन्न विकास की स्थिति में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। एक साथ कई अर्क तैयार करने की क्षमता समय बचाता है और, महत्वपूर्ण बात, विभिन्न नमूनों के बीच तैयारी स्थिरता निकालने सुनिश्चित करता है। एक नकारात्मक नियंत्रण हमेशा आवश्यक है, आदर्श नियंत्रण के साथ ब्याज की इम्यूनोप्रिपिटेटेड प्रोटीन के लिए जीन एन्कोडिंग में एक शून्य उत्परिवर्तन किया जा रहा है (उदाहरण के लिए चित्रा 3 और चित्रा 4 देखें)।
यह निकालने प्रोटोकॉल सी एलिगेंस नमूनों से तेजी से प्रोटीन निकालने की तैयारी के लिए अनुमति देता है और जिरकोनियम मनका आधारित समरूपता8के बराबर है। सामान्य रूप से बीड समरूपता को विभिन्न प्रकार के मनका मिल समरूप या समान उपकरणों का उपयोग करके कई एक साथ नमूना तैयारियों तक बढ़ाया जा सकता है। कुछ और किफायती मनका मिल समरूप नमूनों की संख्या को कम कर सकते हैं जिन्हें एक साथ संसाधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रस्तुत उद्धरण प्रोटोकॉल dounce-आधारित निकालने की तैयारी के साथ संगत है, जो एक किफायती विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि विभिन्न मनका मिल समरूप का परीक्षण नहीं किया गया था, अधिकांश इस प्रोटीन निकालने प्रोटोकॉल के साथ संगत होने की संभावना है, जब तक कि सी एलिगेंस नमूनों का पूर्ण व्यवधान हासिल किया जाता है।
जैसा कि प्रस्तुत किया गया है, यह अर्क तैयारी प्रोटोकॉल कई डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ संगत है, जिसमें प्रोटीन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन2 और माइक्रोआरएनएपुल-डाउन 12 शामिल हैं और प्रोटीन और आरएनए घटकों दोनों के डाउनस्ट्रीम संग्रह के लिए अनुमति देता है। यह परमाणु और साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन(चित्र 2, चित्र 3और चित्र4) दोनों को कुशलतापूर्वक निकालता है। इसी तरह, प्रस्तुत इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रोटोकॉल प्रोटीन से जुड़े इम्यूनोप्रिपिटेट्स से आरएनए अलगाव की अनुमति देता है। जबकि इम्यूनोप्रिपिcipitेशन प्रोटोकॉल मूल रूप से एएलजी-1 प्रोटीन इंटरेक्टर्स की पहचान करने के लिए विकसित किया गया था, विधि ब्याज के किसी भी प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए परीक्षण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । वास्तव में, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की स्थिति ने एएलजी-1(चित्रा 3)और एचआरपीके-1(चित्रा 4)को इम्यूनोप्रिपिपिट करने के लिए समान रूप से अच्छी तरह से काम किया। यह प्रोटोकॉल आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के इम्यूनोपुरिफिकेशन के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि ब्याज के अन्य प्रोटीन के लिए बफर संरचना में कुछ परिवर्तनों की आवश्यकता हो सकती है। परिवर्तन ब्याज के प्रोटीन के भौतिक और जैव रासायनिक गुणों पर निर्भर हो सकते हैं और इसे केस-बाय-केस आधार पर लागू किया जाना चाहिए।
एक बार लक्ष्य प्रोटीन (यहां, एएलजी-1 या एचआरपीके-1) इम्यूनोप्रिपिटेटेड हो जाता है, तो पश्चिमी ब्लॉटिंग का उपयोग विशिष्ट प्रोटीन इंटरएक्टिवेटर के लिए सह-इम्यूनोप्रिपिटेट का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।
वैकल्पिक रूप से, कोपुरीकृत इम्यूनोप्रेसिपिटेट को सभी ख्यात बातचीत प्रोटीन की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है। पुष्टि की सह इम्यूनोप्रिपिक्शन बातचीत तो आनुवंशिक पृष्ठभूमि या शर्तों की एक किस्म में जांच की जा सकती है विशिष्ट बातचीत के संभावित विनियमन की पहचान करने के लिए । उदाहरण के लिए, यह निर्धारित करने के लिए कि क्या एचआरपीके-1 एएलजी-1/AIN-1 miRISC विधानसभा में भूमिका निभाता है, एएलजी-1-AIN-1 सहप्रिक्षति दोनों एक जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में और HRPK-1(चित्रा 3)की अनुपस्थिति में मूल्यांकन किया गया था । एचआरपीके-1 एएलजी-1/AIN-1 इंटरैक्शन2 (चित्रा 3)के लिए डिस्पेबल पाया गया । इसके अलावा, CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी ब्याज के प्रोटीन में एकल बिंदु या डोमेन हटाने उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । उत्पन्न म्यूटेंट की क्षमता को उनके प्रोटीन इंटरप्राक्टेटर के साथ सहप्रेषित करने की क्षमता का पुनर्परीक्षण करने से पता चल सकता है कि कौन से डोमेन या अवशेष शारीरिक बातचीत में मध्यस्थता करते हैं। इस तरह के भविष्य के अध्ययन प्रोटीन समारोह और विनियमन के तंत्र के बारे में अमूल्य जानकारी प्राप्त कर सकते हैं । ये दृष्टिकोण, सी एलिगेंस जेनेटिक्स की शक्ति के साथ संयुक्त, पशु विकास और सेलुलर कार्य को नियंत्रित करने वाली मौलिक आणविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम कंसास इनब्रे, पी 20जीएम103418 द्वारा ली और ज़िनोवयेवा और R35GM124828 से जिनोवयेवा को समर्थित किया गया था। हम मिन हान को उदारता से विरोधी AIN-1 एंटीबॉडी साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं । इस काम के दौरान उपयोग किए जाने वाले कुछ उपभेदों को कैनोरहैब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) द्वारा प्रदान किया गया था, जो एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित थे।
15 mL tube | VWR | 89039-664 | STEP 1.2 |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRed | 1610737 | STEP 3.11 |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRed | 4561096 | STEP 4.1 |
anti-AIN-1 monoclonal antibody | custom generated | n/a | STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007 |
anti-ALG-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
anti-HRPK-1 monoclonal antibody | custom generated by PRF&L | n/a | STEP 4.2 |
Bullet Blender Storm Homogenizer | MidSci | BBY24M | STEP 2.3 |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779-5G | Table 1 |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher | 10002D | STEP 3.2 |
DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | STEP 3.2 |
EDTA-free protease inhibitors | Roche | 11836170001 | Table 1 |
GFP antibody (FL) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8334 | Figure 2 |
Glycerol | Thermo Fisher | G33-500 | Table 1 |
Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP | BioRed | 1662408 | STEP 4.2 |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | 31470 | STEP 4.2 |
HEPES | Sigma | H4034-500G | Table 1 |
LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit | LI-COR | 926-95000 | STEP 4.3 |
Magnesium chloride hexahydrate ACS | VWR | VWRV0288-500G | Table 1 |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Thermo Fisher | M65-500 | Table 1 |
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL | VWR | 20170-333 | STEP 1.6 |
N2 wild type | CGC | ||
Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL) | MidSci | NAVYR1-RNA | STEP 2.3 |
Phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726-1ML | Table 1 |
Phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044-1ML | Table 1 |
Potassium Chloride | Thermo Fisher | P217-500 | Table 1 |
Potassium phosphate monobasic | Thermo Fisher | P285-3 | Table 1 |
RC DC Protein Assay Kit I | BioRed | 5000121 | STEP 2.9 |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | Table 1 |
Sodium Chloride | Thermo Fisher | S271-500 | Table 1 |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Thermo Fisher | S374-500 | Table 1 |
TritionX-100 | Sigma | X100-500ML | Table 1 |
UY38 hrpk-1(zen17) | available upon request | ||
VT1367 col-19::gfp(maIS105) | available upon request | ||
VT3841 alg-1(tm492) | available upon request |