从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复
1Clinical Translational Research Program,RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 2Department of Cardiovascular Surgery, Graduate School of Medicine,Kyoto University, 3Laboratory of Stem Cell and Neuro-Vascular Biology,Cell and Developmental Biology Center, National Institutes of Health, 4Kosair Charities Pediatric Heart Research Program, Cardiovascular Innovation Institute,University of Louisville, 5Department of Pediatrics, School of Medicine,University of Louisville, 6Department of Cardiovascular Surgery,Mitsubishi Kyoto Hospital, 7Cincinnati Children’s Heart Institute
Summary
本协议产生网状工程心脏组织，其中包含来自人类诱导多能干细胞的心血管细胞，以便研究心脏病的细胞植入疗法。
Abstract
目前的协议描述了产生可扩展的网状工程心脏组织（ECTs）的方法，这些组织由来自人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的心血管细胞组成，这些细胞朝着临床使用的目标发展。HiPSC衍生的心肌细胞、内皮细胞和血管壁画细胞与凝胶基质混合，然后倒入具有矩形内部交错柱的聚二甲基硅氧烷（PDMS）组织模具中。到培养日，14个ETS成熟成一个1.5厘米x1.5厘米的网状结构与0.5毫米直径的硫纤维束。心肌细胞与每个束的长轴对齐，并自发地同步跳动。这种方法可以放大到更大的（3.0 厘米 x 3.0 厘米）网格 ECT，同时保持构造成熟度和功能。因此，从hiPSC衍生心脏细胞产生的网状EEC对于心脏再生范式可能是可行的。
Introduction
许多临床前研究和临床试验已经确认了细胞为基础的心脏再生疗法对心脏1，2，3,2失败的有效性。在各种细胞类型中，人类诱导多能干细胞（hiPSCs）凭借其增殖能力、产生各种心血管血统4、5,和全源性的潜力，是有希望的细胞来源。此外,，组织工程技术已经使得将数百万个细胞转移到受损的心脏5，6，7，8。6,758
此前，我们报告了从hiPSC衍生的心血管系生成三维（3D）线性工程心脏组织（ECTs），使用商用的培养系统进行3D生物人工组织5,5，7。我们发现，ECT内血管内皮细胞和壁画细胞与心肌细胞共存，促进了结构和电生理组织的成熟。此外，我们验证了在免疫耐受大鼠心肌梗塞模型中植入hiPSC-ECTs的治疗潜力，以改善心脏功能，再生心肌，增强血管生成5。然而，此方法构建的线性 EC 是 1 mm x 10 mm 圆柱体，因此不适合植入临床前研究与较大的动物或临床用途。
基于成功利用组织模具利用大鼠骨骼肌细胞和心肌细胞9、人类ESC衍生心肌细胞10和小鼠 iPSCs 11生成多孔工程组织形成，我们开发了一种协议，利用聚二11氧化硅氧烷 （PDMS） 霉菌生成可扩展的 hiPSC 衍生更大的可植入组织。我们评估了一系列模具几何形状，以确定最有效的模具特性。与缺少毛孔或结的薄板或线性格式相比，具有多个束和结的网状 EC 在细胞生存能力、组织功能和可伸缩性方面表现出出色的特性。我们把网状ECT植入大鼠心肌梗死模型，并确认其治疗效果类似于植入的圆柱形ECT12。在这里，我们描述了生成 hiPSC 派生网格形状的 ECT 的协议。
Protocol
1. 维护高保和心血管分化 在从小鼠胚胎成纤维细胞（MEF-CM）中提取的有条件介质中，在具有人类基本成纤维细胞生长因子（hbFGF）的中，在薄涂层基底膜基质（生长因子减少，1：60稀释）4上扩展和维护hiPSC。注：我们使用了hiPSCs（4因子（10月3/4，Sox2，Klf4和c-Myc）行：201B6）。在每个细胞系的适当浓度下添加 hbFGF。拉米宁-511片段也可用于培养皿的涂层，而不是地下室膜?…
Representative Results
图1A，B 显示了CM+EC和MC协议的示意图。从CM+EC协议和MC从MC协议诱导CM和EC后，细胞混合调整最终MC浓度，以代表10-20%的总细胞。2 厘米宽的组织模具是根据 0.5 mm 厚 PDMS 板材（图2A，B） 的设计图纸制造的。600万个CM+EC+MC细胞与胶原蛋白一结合，并用基质和马球407预涂的组织模具（图2C）在初步实验中，我们制?…
Discussion
在完成对线性格式（hiPSC衍生的ECT5）的调查后，我们调整了协议，将hiPSC衍生的CMs、EC和MC混合在一起，以促进ETC内血管细胞的体外扩张，以及ECT和接受者心肌之间随后的体内血管耦合。
为了促进更大、可植入的网格 ECT 几何的生成，我们使用薄的 PDMS 表设计 3D 模具，加载柱排列在交错位置。在初步实验中，我们注意到ETS在凝胶压实过程中粘附在PDMS柱上，因?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了路易斯维尔大学Kosair慈善儿科心脏研究项目和RIKEN生物系统动力学研究中心的有机物项目的支持。我们发布的协议中使用的HIPSC由日本京都大学 iPS 细胞研究和应用中心提供。
Materials
| Materials | |||
| Cell Culture Dishes 100×20 mm style | Falcon/ Thomas scientific | 9380C51 | |
| Multiwell Plates For Cell Culture 6well 50/CS | Falcon / Thomas scientific | 6902A01 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761036 | |
| Reagents | |||
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105 | |
| BMP4, recombinant (10µg) | R&D | RSD-314-BP-010 | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356231 | |
| Human VEGF (165) IS, premium grade | Miltenyi | 130-109-385 | |
| Pluronic F-127, 0.2 µm filtered (10% Solution in Water) | Molecular Probes | P-6866 | |
| Recombinant human bFGF | WAKO | 060-04543 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat ActivinA (50µg) | R&D | 338-AC-050 | |
| rh Wnt-3a (10µg) | R&D | 5036-WN | |
| Versene solution | Gibco | 15040066 | |
| Culture medium and supplements | |||
| 10x MEM | Invitrogen | 11430 | |
| 2 Mercaptro Ethanol | SIGMA | M6250 | |
| B27 supplement minus insulin | Gibco | A1895601 | |
| DMEM, high glucose | Gibco | 11965084 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| NaHCO3 | Any | ||
| PBS 1x | Gibco | 10010-031 | |
| Penicillin-Streptomycin (5000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| RPMI1640 medium | Gibco | 21870092 | |
| αMEM | Invitrogen | 11900024 | |
| Flowcytometry | |||
| anti-TRA-1-60, FITC, Clone: TRA-1-60, BD Biosciences | BD / Fisher | 560380 | |
| anti-Troponin T, Cardiac Isoform Ab-1, Clone: 13-11, Thermo Scientific Lab Vision | Fisher | MS-295-P0 | |
| BD FACS Clean Solution | BD | 340345 | |
| BD FACSFlow Sheath Fluid | BD | 342003 | |
| BD FACSRinse Solution | BD | 340346 | |
| EDTA | Any | ||
| Falcon Tube with Cell Strainer Cap (Case of 500) | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum (500ml) | Any | ||
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Molecular Probes | L34957 | |
| PDGFRb; anti-CD140b, R-PE, Clone: 28D4, BD Biosciences | BD / Fisher | 558821 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47306-50G-F | |
| VEcad-FITC; anti-CD144, FITC, Clone: 55-7H1, BD Biosciences | BD / Fisher | 560411 | |
| Zenon Alexa Fluor 488 Mouse IgG1 Labeling Kit | Molecular Probes | Z25002 |
References
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Cite This Article
Nakane, T., Abulaiti, M., Sasaki, Y., Kowalski, W. J., Keller, B. B., Masumoto, H. Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair. J. Vis. Exp. (160), e61246, doi:10.3791/61246 (2020).