घाव-प्रेरित पॉलीप्लॉयडाइजेशन एक संरक्षित ऊतक मरम्मत रणनीति है जहां कोशिकाओं को कोशिका हानि की भरपाई के लिए विभाजित करने के बजाय आकार में वृद्धि होती है। यहां एक मॉडल के रूप में फल मक्खी का उपयोग करने के लिए एक मॉडल के रूप में कैसे प्लॉय और एपिथेलियल घाव की मरंमत में अपने आनुवंशिक विनियमन को मापने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है ।
पॉलीप्लाइडी एक बार घटना है जिसका प्रभाव संगठित स्वास्थ्य और बीमारी पर अभी भी खराब समझ में आता है । एक कोशिका को पॉलीप्लाइड के रूप में परिभाषित किया जाता है यदि इसमें इसके गुणसूत्रों की डिप्लॉयड कॉपी से अधिक होता है, जो एंडोरेसिकेशन या सेल फ्यूजन का परिणाम होता है। ऊतक की मरम्मत में, घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन (डब्ल्यूआईपी) फल मक्खियों से कशेरुकी तक एक संरक्षित चिकित्सा रणनीति पाई गई है। WIP सेल प्रसार पर कई फायदे हैं, जिसमें ऑन्कोजेनिक विकास और जेनोटॉक्सिक तनाव के प्रतिरोध शामिल हैं। चुनौती यह पहचानने की रही है कि पॉलीप्लॉयड कोशिकाएं क्यों उत्पन्न होती हैं और ये अनूठी कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं। बशर्ते वयस्क फल फ्लाई एपिथेलियम में WIP का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है जहां पंचर घाव के बाद 2 दिनों के भीतर पॉलीप्लाइड कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं। डी मेलनोगास्टर के व्यापक आनुवंशिक उपकरण किट का लाभ उठाते हुए, Myc सहित WIP को शुरू करने और विनियमित करने के लिए आवश्यक जीन की पहचान शुरू हो गई है । इस विधि का उपयोग करके जारी अध्ययनों से पता चल सकता है कि सेक्स, आहार और उम्र सहित अन्य आनुवंशिक और शारीरिक चर WIP के कार्य को कैसे विनियमित और प्रभावित करते हैं।
ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर एपिथेलियल घाव की मरम्मत के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक मॉडल प्रणाली है। स्तनधारियों के रूप में, ऊतक मरम्मत तंत्र ऊतक और उसके विकास के चरण दोनों पर निर्भर करता है। जख्मी घाव भरने का काम फल मक्खी भ्रूण में होता है जहां एपिथेलियल लीडिंग एज पर एक एक्टोमायोसिन “पर्स स्ट्रिंग” रूपों में घाव को मूल रूप से बंद करने में सक्षम बनाता है1,2. लार्वा, पिल्ला और वयस्क फल मक्खियों में भ्रूणीय घाव भरने के परिणामस्वरूप एक्सेरैलुलर मैट्रिक्स रीमॉडलिंग, मेलेनिन निशान गठन, और एपिथेलियल सेल विकास3,,4,,5, 6,होताहै। एपिथेलियल कोशिकाएं कोशिका संलयन और एंडोसाइकिल द्वारा आकार में वृद्धि करती हैं, एक अधूरा कोशिका चक्र जो माइटोसिस 3 ,,4,4,7,8को बाईपास करता है।, नतीजतन, सेल लॉस की भरपाई सेल डिवीजन के बजाय पॉलीप्लॉयड सेल ग्रोथ से की जाती है । वयस्क फ्लाई हिंडगट, मिडगट और कूप एपिथेलियम भी,ऊतक क्षति9,10, 11के बाद सेल नुकसान की भरपाई के लिए पॉलीप्लाइड सेल विकास पर भरोसाकरतेहैं।,
पॉलीप्लाइडी पौधों और कीड़ों में संगठनीय विकास का एक प्रसिद्ध पहलू है, लेकिन पिछले कुछ वर्षों में यह अधिक स्पष्ट हो गया है कि पॉलीप्लाइडी कशेरुकी12में एक संरक्षित ऊतक मरम्मत रणनीति है। जेब्राफिश, जिसमें अपने दिल को पुनर्जीवित करने की क्षमता है, क्षतिग्रस्त एपिकार्डियम13को ठीक करने के लिए पॉलीप्लाइड सेल विकास पर निर्भर करता है। 14,15एक्यूट इंजरी के बाद स्तनधारी लिवर के14उत्थान और किडनी ट्यूबुल एपिथेलियम रिपेयर में पॉलीप्लाइडी का भी योगदान है . इन उदाहरणों में, पॉलीप्लाइड कोशिकाएं एंडोरिसाइकल या एंडोमाइटोसिस के माध्यम से एंडोरिपिकेशन द्वारा उत्पन्न होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप साइटोकिनेसिस12में ब्लॉक के कारण एक बाईन्यूक्लियेटेड सेल होता है। पहेली यह है कि घाव की मरम्मत के दौरान पॉलीप्लॉयड कोशिकाएं उत्पन्न होती हैं और पॉलीप्लॉयड ऊतक कार्य को कैसे प्रभावित करती हैं। हाल के अध्ययनों ने इस सवाल में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है कि क्या पॉलीप्लॉयी एक चिकित्सा लाभ या नुकसान प्रदान करता है। जेब्राफिश एपिकार्डियम में पॉलीप्लॉयडी ने घाव भरने की गतिको बढ़ाया 13। डी मेलनोगेस्टर हिंडगट और स्तनधारी जिगर में, पॉलीप्लाइडी को ऑन्कोजेनिक विकास11, 14,14के खिलाफ सुरक्षात्मक पाया गया । वयस्क फ्लाई एपिथेलियम में, हाल ही में पाया गया था कि पॉलीप्लॉयी जीनोटॉक्सिक तनाव16की उपस्थिति में घाव की मरम्मत में सक्षम बनाता है। एंडोरेप्लिकेशन डीएनए क्षति के लिए प्रतिरोधी है, जब कोशिका प्रसार अन्यथा17से समझौता किया जाएगा तो घाव भरने की अनुमति देता है। माउस और जेब्राफिश दिलों में कार्डियोमायोसाइट्स के लिए, हालांकि, पॉलीप्लाइडी उपचार को धीमा कर देता है, जिसके परिणामस्वरूप18, 19,19में बढ़ी हुई निशान गठन होता है। इसलिए, अंग और/या सेल प्रकार के आधार पर, पॉलीप्लॉयी एक फायदेमंद या हानिकारक ऊतक मरम्मत रणनीति हो सकती है । घाव-प्रेरित पॉलीप्लाइडाइजेशन (डब्ल्यूआईपी) प्रतिक्रिया के विश्लेषण के साथ-साथ डी मेलनोगेस्टर जेनेटिक्स की पहुंच इसे आणविक और सेलुलर तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली बनाती है जो इस घाव चिकित्सा रणनीति का मार्गदर्शन करती है।
यहां, हम वयस्क डी मेलनोगास्टर एपिथेलियम में WIP का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। शामिल फल मक्खी की चोट, विच्छेदन, इम्यूनोदाता, बढ़ते, इमेजिंग, और फिर से epithelialization, सेल संलयन, और एंडोरिपेशन (प्लॉयडी) के विश्लेषण के लिए निर्देश हैं । इमेजिंग और प्लॉयडी विश्लेषण को अन्य मॉडलों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि WIP होता है या नहीं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परमाणु डीएनए सामग्री में वृद्धि के साथ अक्सर परमाणु आकार में इसी वृद्धि होती है । हालांकि, जीव विज्ञान में ऐसे कई उदाहरण हैं जहां परमाणु आकार प्लॉयडी20में इसी परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं करता है। घाव के वातावरण के संदर्भ में परमाणु आकार की व्याख्या करते समय और भी अधिक सावधानी बरती जानी चाहिए जहां कोशिकाएं अक्सर घाव स्थल को कवर करने के लिए फैलती हैं या खिंचाव करती हैं। इसलिए, प्लॉयडी में परिवर्तन का एकमात्र निश्चित प्रमाण इस विधि (या अन्य, जैसे पूरे जीनोम अनुक्रमण)21द्वारा डीएनए सामग्री को मापना है। इस विधि घाव की मरम्मत में पॉलीप्लाइडी की भूमिका और विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में वयस्क डी मेलनोगास्टर पेट एपिथेलियम की उपयुक्तता को बढ़ाता है।
प्रस्तुत कैसे विच्छेदन और वयस्क डी मेलनोगेस्टर पेट एपिथेलियम का उपयोग करने के लिए अध्ययन कैसे जीन घाव की मरंमत16के दौरान फिर से epithelialization और अंतःकरण में फेरबदल करके WIP को विनियमित करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल है । इस विधि का उपयोग करते हुए, प्रोटो-ऑन्कोजीन माइक को हाल ही में WIP के एक प्रमुख नियामक के रूप में पहचाना गया था। माईक के लिए एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए चोट के बाद एंडोरेंट करने की आवश्यकता होती है और यह वयस्क फ्लाई एपिथेलियम और सहायक ग्रंथियों16,22दोनों में अंत : एपिथेलियल कोशिकाओं को एंडोसाइकिल करने के लिए पर्याप्त है । यह भी पाया गया कि एसटीजी की अभिव्यक्ति द्वारा एपिथेलियल कोशिकाओं को मिटोटिक सेल चक्र में स्विच करना, एफजेडआरआरएनएआई घाव की मरम्मत के लिए हानिकारक है। इस विधि का उपयोग कर जारी अध्ययन WIP के दौरान पुनः epithelialization और अंतःकरण को विनियमित करने के लिए आवश्यक अन्य जीन की पहचान करेगा, दोनों समानताएं और मतभेदों को उजागर कैसे पॉलीप्लाइडी विनियमित है और ऊतकों की एक किस्म में कार्य करता है ।
यह मॉडल और विधि एक यांत्रिक पंचर के साथ पॉलीप्लाइडी के आसान शामिल होने और तथ्य यह है कि पॉलीप्लॉयड कोशिकाओं को4दिनों के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं सहित अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं। ऊतक विच्छेदन और तैयारी प्रोटोकॉल लार्वा विच्छेदनतकनीकों परआधारित हैं, लेकिन वयस्क फ्लाई पेट अधिक कठोर है और इसलिए आसानी से परेशान है। नतीजतन, इस प्रोटोकॉल को WIP का अध्ययन करने के लिए एक अक्षुण्ण ऊतक को अलग करने के लिए अभ्यास और परिशुद्धता की आवश्यकता होती है। एक बार विच्छेदन होने के बाद, हालांकि, एपिथेलियम स्पष्ट रूप से दिखाई देता है और आसानी से चित्रित होता है, जिससे घाव भरने की प्रक्रिया का स्नैपशॉट होता है। यह विधि वयस्क फ्लाई के एपिथेलियल संगठन, सेल और सिंक्टियम आकार, और कोशिकाओं और व्यक्तिगत नाभिक की प्लॉयडी के बारे में जानकारी का खजाना प्रदान करती है। जबकि लाइव इमेजिंग अभी तक अपने अपारदर्शी क्यूटिकल के कारण अक्षुण्ण फल मक्खी के भीतर संभव नहीं है, इस प्रोटोकॉल को वर्तमान में उपलब्ध पूर्व वीवो संस्कृति शर्तों को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो अल्पकालिक लाइव इमेजिंग अध्ययन24करने के लिए डी मेलानोगास्टर में उपयोग किया जाता है।
भविष्य में, यह मॉडल सेल-टू-सेल क्रॉसटॉक का अध्ययन करने और अन्य सेल प्रकारों के योगदान को अन्य सेल प्रकारों में Gal4/UAS प्रणाली के साथ जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करके WIP में आदर्श होगा । इसी तरह के सवालों के जवाब भी कई तरह की जेनेटिक और म्यूटेंट बैकग्राउंड का इस्तेमाल कर सकते हैं । विच्छेदित वयस्क फ्लाई पेट में विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार होते हैं जिन्हें वसा शरीर और ओनोसाइट्स, पार्श्व मांसपेशी फाइबर, संवेदी न्यूरॉन्स, ट्रेकिया और मैक्रोफेज जैसे हेमोसाइट्स सहित इस विधि का उपयोग करके आसानी से कल्पना की जा सकती है। इसके अलावा, यह मॉडल शोधकर्ताओं को यह जांच करने की अनुमति देगा कि शारीरिक चर सेक्स, आहार, संक्रमण, उम्र और पर्यावरणीय तनाव सहित WIP को कैसे प्रभावित करते हैं। जबकि प्रोटोकॉल अपने बड़े आकार के कारण वयस्क मादा फ्लाई का उपयोग करता है, WIP पुरुष फल फ्लाई (Gjelsvik और Losick, अप्रकाशित) में भी होता है। स्तनधारी जिगर, मस्तिष्क, आंख और दिल12में उम्र बढ़ने और उम्र से जुड़ी बीमारी के दौरान पॉलीप्लाइड कोशिकाएं उत्पन्न पाई गई हैं । फ्रूट फ्लाई मॉडल शोधकर्ताओं को शारीरिक और रोग के संदर्भों में पॉलीप्लॉयाइजेशन का अध्ययन करने में सक्षम बनाएगा क्योंकि मानव रोग से संबंधित जीन अत्यधिक संरक्षित हैं ।
The authors have nothing to disclose.
बोस्टन कॉलेज में, हम बुनियादी ढांचे और समर्थन के लिए बोस्टन कॉलेज इमेजिंग कोर में इमेजिंग और Bret Judson के लिए अपनी प्रयोगशाला के कैमरे और स्टीरियोस्कोप माइक्रोस्कोप सेटअप के उपयोग के लिए डॉ एरिक Folker शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम फ्लाई सामुदायिक संसाधनों का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे: ब्लूमिंगटन ड्रोसोफिला स्टॉक सेंटर (NIH P40OD018537), वियना ड्रोसोफिला रिसोर्स सेंटर, और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल में TRiP केंद्र (NIH/NIGMS R01-GM084947) इस अध्ययन में इस्तेमाल ट्रांसजेनिक स्टॉक प्रदान करने के लिए । माउस FasIII एंटीबॉडी एनआइएच के NICHD द्वारा समर्थित विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक से प्राप्त किया गया था और आयोवा विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, आयोवा सिटी, आईए में बनाए रखा । इस प्रकाशन में सूचित शोध पुरस्कार संख्या R35GM124691 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करता है ।
35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |