ثقافة بيريكيتس الشعيرات الدموية في الدماغ لقياسات الكالسيوم السيتوسوليك ودراسات تصوير الكالسيوم
Summary
البيريات الشعيرات الدموية هي لاعبين أساسيين في تنظيم خصائص حاجز الدم في الدماغ وتدفق الدم. يصف هذا البروتوكول كيف يمكن عزل الشعيرات الشعرية في الدماغ، واستزراعها، وتتميز فيما يتعلق بنوع الخلية، وتطبيقها على التحقيقات في إشارات الكالسيوم داخل الخلايا مع تحقيقات الفلورسنت.
Abstract
ترتبط الـ Pericytes بالخلايا البطانية و endfeet الفلكية في بنية تعرف باسم الوحدة العصبية الوعائية (NVU). وظيفة بيريميري الدماغ غير معروفة تماما. وقد اقترح Pericytes للمشاركة في تطوير الشعيرات الدموية، وتنظيم ضيق الحاجز البطانية ونشاط trancytosis، وتنظيم لهجة الشعرية ولعب أدوار حاسمة في بعض أمراض الدماغ.
Pericytes هي صعبة للتحقيق في الدماغ سليمة بسبب صعوبات في تصور العمليات في الدماغ parenchyma، فضلا عن القرب من الخلايا الأخرى من NVU. يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل وثقافة الشعيرات الدموية الدموية الأولية في الدماغ واستخدامها التالي في دراسات تصوير الكالسيوم ، حيث يمكن التحقيق في آثار ناهضين يشاركون في إشارات الدماغ والأمراض. يسمح لشظايا الشعيرات الدموية القشرية بالتعلق بأسفل قارورة الثقافة ، وبعد 6 أيام ، نمت الخلايا البطانية والخلايا من شظايا الشعيرات الدموية. تتم إزالة الخلايا البطانية عن طريق التربسينسيس لطيف ويتم استزراع pericytes لمدة 5 أيام إضافية قبل passaging.
يتم بذر pericytes المعزولة في 96-جيدا لوحات ثقافة وتحميلها مع صبغة مؤشر الكالسيوم (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) للسماح لقياس مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في إعداد قارئ لوحة. بدلاً من ذلك، يتم بذر البيريسيت على الأغطية ويتم تركيبها في غرف الخلايا. بعد التحميل مع مؤشر الكالسيوم (Cal-520 AM)، يمكن إجراء التصوير الحي للكالسيوم باستخدام المجهر الناظر في الطول الموجي للإثارة من 488 نانومتر والطول الموجي للانبعاثات من 510-520 نانومتر.
وقد استخدمت الطريقة المذكورة هنا للحصول على قياسات الكالسيوم الأولى داخل الخلايا من بيريكيات الشعيرات الدموية الأولية في الدماغ، مما يدل على أن يتم تحفيز بيريكيتس عن طريق ATP وقادرة على العقد في المختبر.
Introduction
الشعيرات الدموية في الدماغ، جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية والخلايا الفلكية، تشكل NVU1،2،3. تشكل الخلايا البطانية ، التي تشكل الأساس الهيكلي للعيعييات ، أنابيب أسطوانية طويلة بقطر 5-8 ميكرومتر. وتغطي الخلايا البطانية بشكل متقطع مع الخصيات وتحيط بها نتوءات من الخلايا الفلكية; endfeet الفلكية.
حاجز الدم في الدماغ (BBB)، يقع في الشعيرات الدموية في الدماغ، هو الموقع الرئيسي لتبادل المواد الغذائية والغازات ونفايات المنتجات بين الدماغ والدم. كما يحمي BBB الدماغ من السموم العصبية الذاتية والخارجية، ويعمل كحاجز لإيصال عدد كبير من مركبات المخدرات. وظيفة الحاجز هو مجال التركيز، فضلا عن عقبة، لشركات الأدوية تطوير أدوية الجهاز العصبي المركزي (CNS). وقد أثار هذا اهتماما كبيرا في التحقيق في خلايا NVU في الثقافة4. وقد تم زراعة الخلايا الفلكية في الدماغ والخلايا البطانية وتتميز في عدد من الدراسات، في حين أن الدراسات والبروتوكولات لثقافة البيرثيت متناثرة.
وقد وصفت البروتوكولات المنشورة سابقا جيل من الثقافات الشعيرات الدموية في الدماغ إلى حد ما، وذلك باستخدام مجموعة من النهج المختلفة مثل المناعة5،وسائل الإعلام عالية ومنخفضة الجلوكوز6،الخلايا الفلورية المنشطة فرز7،كثافة الانحدار المركزي8،الخ. على الرغم من أن هذه الأساليب تبدو كافية للحصول على ثقافات من pericytes، وبعضها مضيعة للوقت، وتكلفة باهظة الثمن وال pericytes الحصول على قد لا تكون مثالية نظرا لعدد من الممرات الثقافة التي يمكن أن دي- تمييز pericytes9. وعلاوة على ذلك، فإن إمكانات pericytes مثقف في دراسات الإشارات في المختبر لم يتم استكشافها إلى حد ما حتى الآن.
يركز العمل الحالي على توليد ثقافات pericyte من الشعيرات الدموية المخية البقرية المعزولة والإعداد اللاحق للقياسات ودراسات التصوير للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ، وهو رسول ثانٍ مهم داخل الخلايا. نحن نصف بإيجاز عزل الشعيرات الدموية عن المادة الرمادية القشرية (للحصول على التفاصيل انظر هيلمز وآخرون10)وعزل وثقافة البيريثيات في زراعة أحادية نقية دون تلوث مع الخلايا البطانية أو الدبقية. ثم نقدم بروتوكولا لبذات من pericytes في 96-جيدا لوحات وبروتوكولات التحميل لمسبار الكالسيوم فورا -2 AM. وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن استخدام البيرليكات في التصوير confocal في الوقت الحقيقي في غرف ثقافة المجهر ووصف البروتوكولات لهذا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، قمنا بتقديم طريقة لعزل البيرليكات الأولية من أدمغة الأبقار. البروتوكول الموصوف يسمح الثقافة من هذا النوع خلية غير قابلة للوصول بدلاً من ذلك. في وقت لاحق تم الحصول على ثقافة الخلية هو سكان متجانس تقريبا من pericytes، مع تلوث قليل أو معدومة مع الخلايا البطانية والخلايا الدبقية ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يرغب المؤلفون في الاعتراف بالتمويل من مبادرة أبحاث مؤسسة لوندبيك حول حواجز الدماغ وتسليم الأدوية (RIBBDD) ومؤسسة عائلة سيمون هوغنرز.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
