Cultivo de pericitos capilares cerebrales para mediciones de calcio citosólico y estudios de imágenes de calcio
Summary
Los pericitos capilares cerebrales son actores esenciales en la regulación de las propiedades de la barrera hematoencefálica y el flujo sanguíneo. Este protocolo describe cómo los pericitos capilares cerebrales pueden ser aislados, cultivados, caracterizados con respecto al tipo de célula y aplicados para investigaciones de señalización de calcio intracelular con sondas fluorescentes.
Abstract
Los pericitos se asocian con células endoteliales y endfeet astrocíticos en una estructura conocida como unidad neurovascular (NVU). La función del pericito capilar cerebral no se conoce completamente. Se ha sugerido que los pericitos participan en el desarrollo capilar, la regulación de la opresión de la barrera endotelial y la actividad de la transcitosa, la regulación del tono capilar y desempeñan un papel crucial en ciertas patologías cerebrales.
Los pericitos son difíciles de investigar en el cerebro intacto debido a las dificultades en la visualización de los procesos en el parénquima cerebral, así como la proximidad a las otras células de la NVU. El presente protocolo describe un método para el aislamiento y el cultivo de pericitos capilares primarios del cerebro bovino y su siguiente uso en estudios de imágenes de calcio, donde se pueden investigar los efectos de los agonistas involucrados en la señalización cerebral y las patologías. Se permite que los fragmentos capilares corticales se adhieran al fondo de los matraces de cultivo y, después de 6 días, las células endoteliales y los pericitos han crecido a partir de los fragmentos capilares. Las células endoteliales se eliminan mediante la trippsinación suave y los pericitos se cultivan durante 5 días adicionales antes de la transeúncia.
Los pericitos aislados se siembran en placas de cultivo de 96 pozos y se cargan con el tinte indicador de calcio (Fura-2 acetoximetil (AM)) para permitir mediciones de los niveles de calcio intracelular en una configuración del lector de placas. Alternativamente, los pericitos se siembran en los cubreobjetos y se montan en cámaras celulares. Después de la carga con el indicador de calcio (Cal-520 AM), las imágenes en vivo de calcio se pueden realizar utilizando microscopía confocal a una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 510-520 nm.
El método descrito aquí se ha utilizado para obtener las primeras mediciones intracelulares de calcio de pericitos capilares primarios del cerebro, demostrando que los pericitos se estimulan a través de ATP y son capaces de contraerse in vitro.
Introduction
Los pericitos capilares cerebrales, junto con las células endoteliales y los astrocitos, constituyen el NVU1,2,3. Las células endoteliales, que forman la base estructural de los capilares, forman largos tubos cilíndricos con un diámetro de 5-8 m. Las células endoteliales están esporádicamente cubiertas de pericitos y rodeadas de protuberancias de astrocitos; el final del astrocito.
La barrera hematoencefálica (BBB), situada en los capilares cerebrales, es el sitio principal para el intercambio de nutrientes, gases y productos de desecho entre el cerebro y la sangre. El BBB también protege el cerebro de las neurotoxinas endógenas y exógenas y sirve como una barrera para la entrega de un gran número de compuestos de drogas. La función de barrera es un área de enfoque, así como un obstáculo, para las compañías farmacéuticas que desarrollan medicamentos del sistema nervioso central (SNC). Esto ha suscitado un gran interés en investigar las células de la NVU en el cultivo4. Los astrocitos cerebrales y las células endoteliales se han cultivado y caracterizado en una serie de estudios, mientras que los estudios y protocolos para el cultivo de pericitos son escasos.
Los protocolos publicados anteriormente han descrito la generación de cultivos de pericito capilar cerebral hasta cierto punto, utilizando una gama de enfoques diferentes como inmunopanning5,medios de alta y baja glucosa6,clasificación celular activada por fluorescentes7, centrifugación de gradiente de densidad8,etc. Aunque estos métodos parecen suficientes para obtener cultivos de pericitos, algunos consumen mucho tiempo, son costosos y los pericitos obtenidos podrían no ser ideales debido al número de pasajes de cultivo que pueden des-diferenciar los pericitos9. Además, el potencial de los pericitos cultivados en estudios de señalización in vitro ha sido bastante inexplorado hasta ahora.
El presente trabajo se centra en la generación de cultivos de pericitos a partir de capilares cerebrales bovinos aislados y la posterior configuración para mediciones y estudios por imágenes de cambios en el calcio intracelular, un importante segundo mensajero intracelular. Describimos brevemente el aislamiento de capilares de materia gris cortical (para más detalles ver Helms et al.10) y el aislamiento y cultivo de pericitos en monocultivo puro sin contaminación con células endoteliales o gliales. A continuación, proporcionamos un protocolo para la siembra de pericitos en placas de 96 pozos y protocolos de carga para la sonda de calcio Fura-2 AM. Por último, mostramos cómo se pueden utilizar pericitos en imágenes confocales en tiempo real en cámaras de cultivo de microscopio y describimos los protocolos para ello.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, hemos presentado un método para aislar pericitos primarios de cerebros bovinos. El protocolo descrito permite la referencia cultural de este tipo de celda bastante inaccesible. El cultivo celular obtenido posteriormente fue una población casi homogénea de pericitos, con poca o ninguna contaminación con células endoteliales y células gliales basadas en morfología celular y expresión proteica12. Además, demostramos un método simple y sencillo para cargar los pericitos con …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer la financiación de la iniciativa de investigación de la Fundación Lundbeck sobre barreras cerebrales y entrega de drogas (RIBBDD) y la Fundación de la Familia Simon Hougners.
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
References
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, Physiological, and Pathological Perspectives, Problems, and Promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. The Perivascular Astroglial Sheath Provides a Complete Covering of the Brain Microvessels: An Electron Microscopic 3D Reconstruction. Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Zhou, L., Sohet, F., Daneman, R. Purification of Pericytes from Rodent Optic Nerve by Immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. , 608-617 (2014).
- Liu, G. H., et al. Isolation, Purification, and Cultivation of Primary Retinal Microvascular Pericytes: A Novel Model Using Rats. Microcirculation. 21 (6), 478-489 (2014).
- Nayak, R. C., Herman, I. M. Bovine retinal microvascular pericytes: isolation, propagation, and identification. Methods In Molecular Medicine. 46, 247-263 (2001).
- Nees, S., et al. Isolation, bulk cultivation, and characterization of coronary microvascular pericytes: the second most frequent myocardial cell type in vitro. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 302 (1), H69-H84 (2012).
- Armulik, A., Abramsson, A., Betsholtz, C. Endothelial/pericyte interactions. Circulation Research. 97 (6), 512-523 (2005).
- Helms, H. C., Brodin, B., Milner, R. Methods in Molecular Biology. Cerebral Angiogenesis: Methods and Protocols. 1135, 365-382 (2014).
- Abbracchio, M. P., Burnstock, G., Verkhratsky, A., Zimmermann, H. Purinergic signalling in the nervous system: an overview. Trends in Neurosciences. 32 (1), 19-29 (2009).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced rises in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses in brain capillaries. PNAS. , (2018).
- Tigges, U., Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain. Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).
- Maier, C. L., Shepherd, B. R., Yi, T., Pober, J. S. Explant Outgrowth, Propagation and Characterization of Human Pericytes. Microcirculation. 17 (5), 367-380 (2010).
- Orlidge, A., Damore, P. A. Cell specific effects of glycosaminoglycans on the attachment and proliferation of vascular wall components. Microvascular Research. 31 (1), 41-53 (1986).
- Rhinehart, K., Zhang, Z., Pallone, T. L. Ca2+ signaling and membrane potential in descending vasa recta pericytes and endothelia. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 283, F852-F860 (2002).
- Bintig, W., et al. Purine receptors and Ca2+ signalling in the human blood-brain barrier endothelial cell line hCMEC/D3. Purinergic Signalling. 8 (1), 71-80 (2012).
- Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).
- Kamouchi, M., et al. Calcium influx pathways in rat CNS pericytes. Molecular Brain Research. 126 (2), 114-120 (2004).
- Das, A., et al. ATP Causes Retinal Pericytes to Contract In vitro. Experimental Eye Research. 46, 349-362 (1988).
