साइटोसोलिक कैल्शियम मापन और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन के लिए मस्तिष्क केपिलरी पेरिसिटस की संस्कृति
Summary
मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स रक्त-मस्तिष्क बाधा गुणों और रक्त प्रवाह के नियमन में आवश्यक खिलाड़ी हैं। यह प्रोटोकॉल बताता है कि मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स को अलग, सुसंस्कृत, कोशिका प्रकार के संबंध में विशेषता और फ्लोरोसेंट जांच के साथ इंट्रासेलुलर कैल्शियम सिग्नलिंग की जांच के लिए कैसे लागू किया जा सकता है।
Abstract
पेरिसाइट्स न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) के रूप में जानी जाने वाली संरचना में एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइटिक एंडफीट से जुड़े होते हैं। मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट फ़ंक्शन पूरी तरह से ज्ञात नहीं है। पेरिसिटस को केशिका विकास, एंडोथेलियल बैरियर जकड़न और ट्रांसिएंटोसिस गतिविधि के नियमन, केशिका टोन के नियमन और कुछ मस्तिष्क विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए शामिल होने का सुझाव दिया गया है ।
मस्तिष्क परेन्चिमा में प्रक्रियाओं की कल्पना में कठिनाइयों के साथ-साथ एनवीयू की अन्य कोशिकाओं के करीब निकटता के कारण पेरिसाइट्स अक्षुण्ण मस्तिष्क में जांच करना चुनौतीपूर्ण हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक गोजातीय मस्तिष्क केशिका pericytes की संस्कृति और कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन में उनके निम्नलिखित उपयोग के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जहां मस्तिष्क संकेत और विकृतियों में शामिल agonists के प्रभाव की जांच की जा सकती है । कॉर्टिकल केशिका के टुकड़ों को संस्कृति फ्लास्क के नीचे से संलग्न करने की अनुमति है और, 6 दिनों के बाद, एंडोथेलियल कोशिकाएं और पेरिसाइट्स केशिका टुकड़ों से बाहर हो गए हैं। एंडोथेलियल कोशिकाओं को कोमल ट्राइप्सिनाइजेशन द्वारा हटा दिया जाता है और पारिसाइट्स को पास बढ़ने से पहले 5 अतिरिक्त दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है।
अलग पेरिसाइट्स को 96-अच्छी संस्कृति प्लेटों में वरीयता प्राप्त किया जाता है और प्लेट रीडर सेटअप में इंट्रासेलुलर कैल्शियम के स्तर के माप के लिए अनुमति देने के लिए कैल्शियम इंडिकेटर डाई (फ्यूरा-2 एसीटॉक्सीमिथिल (एएम) से भरा हुआ है। वैकल्पिक रूप से, पेरिसाइट्स को कवरस्लिप पर वरीयता दी जाती है और सेल कक्षों में घुड़सवार किया जाता है। कैल्शियम इंडिकेटर (सीएएल-520 AM) के साथ लोड होने के बाद, कैल्शियम लाइव-इमेजिंग 488 एनएम की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य और 510-520 एनएम की उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके किया जा सकता है।
यहां वर्णित विधि प्राथमिक मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स से पहले इंट्रासेलुलर कैल्शियम माप प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, यह प्रदर्शित करता है कि पेरिसाइट्स एटीपी के माध्यम से उत्तेजित होते हैं और विट्रो में अनुबंध करने में सक्षम होते हैं।
Introduction
मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाओं और एस्ट्रोसाइट्स के साथ, एनवीयू1,2,3 कागठनकरते हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं, जो केशिकाओं का संरचनात्मक आधार बनाती हैं, 5-8 माइक्रोन के व्यास के साथ लंबी बेलनाकार ट्यूब बनाती हैं। एंडोथेलियल कोशिकाएं कई मायनों में पेरिसाइट्स से ढकी होती हैं और एस्ट्रोसाइट्स से फलाव से घिरी होती हैं; एस्ट्रोसाइट एंडफीट।
मस्तिष्क केशिकाओं में स्थित रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) मस्तिष्क और रक्त के बीच पोषक तत्वों, गैसों और अपशिष्ट उत्पादों के आदान-प्रदान के लिए मुख्य स्थल है । बीबीबी मस्तिष्क को अंतर्जात और एक्सोजेनस न्यूरोटॉक्सिन से भी बचाता है और बड़ी संख्या में दवा यौगिकों के वितरण के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करता है। बैरियर फ़ंक्शन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) दवाओं के विकास वाली दवा कंपनियों के लिए एक फोकस क्षेत्र है, साथ ही एक बाधा है। इससे संस्कृति4में एनवीयू की कोशिकाओं की जांच करने में बड़ी रुचि बढ़ी है . मस्तिष्क एस्ट्रोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाओं को कई अध्ययनों में सुसंस्कृत और विशेषता दी गई है, जबकि पेरिसाइट संस्कृति के लिए अध्ययन और प्रोटोकॉल विरल हैं।
पहले प्रकाशित प्रोटोकॉलों में मस्तिष्क केशिका पेरिसाइट संस्कृतियों की पीढ़ी को कुछ हद तक वर्णित किया गया है, जिसमें इम्यूनोपैनिंग5,उच्च और कम ग्लूकोज मीडिया6,फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छंटाई7,घनत्व ढाल अपकेंद्रितरण8आदि जैसे विभिन्न दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला का उपयोग करके। यद्यपि ये विधियां पेरिसाइट्स की संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त लगती हैं, कुछ समय लेने वाली होती हैं, लागत महंगी होती है और प्राप्त पेरिसाइट्स संस्कृति मार्गों की संख्या के कारण आदर्श नहीं हो सकते हैं जो पेरिसाइट्स9को डी-अंतर कर सकते हैं। इसके अलावा, इन विट्रो सिग्नलिंग अध्ययनों में सुसंस्कृत पेरिसाइट्स की क्षमता अब तक काफी बेरोज़गार है।
वर्तमान कार्य अलग गोजातीय मस्तिष्क केशिकाओं से पेरिसाइट संस्कृतियों की पीढ़ी और इंट्रासेलुलर कैल्शियम में परिवर्तन के माप और इमेजिंग अध्ययन के लिए बाद के सेटअप पर केंद्रित है, जो एक महत्वपूर्ण इंट्रासेलुलर दूसरा दूत है। हम संक्षेप में कॉर्टिकल ग्रे मैटर से केशिकाओं के अलगाव का वर्णन करते हैं (विवरण के लिए हेल्म्स एट अल10देखें) और एंडोथेलियल या ग्लियल कोशिकाओं के साथ संदूषण के बिना शुद्ध मोनोकल्चर में पेरिसाइट्स की अलगाव और संस्कृति। इसके बाद हम कैल्शियम प्रोब फ्यूरा-2 एएम के लिए 96-वेल प्लेटों और लोडिंग प्रोटोकॉल में पेरिसाइट्स के सीडिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि माइक्रोस्कोप संस्कृति कक्षों में वास्तविक समय कॉन्फोकल इमेजिंग में पेरिसाइट्स का उपयोग कैसे किया जा सकता है और इसके लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हमने प्राथमिक पेरिसाइट्स को गोजातीय दिमाग से अलग करने का एक तरीका प्रस्तुत किया है। वर्णित प्रोटोकॉल इस अन्यथा दुर्गम सेल प्रकार की संस्कृति की अनुमति देता है। बाद में प्राप्त कोशिका स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक ब्रेन बैरियर्स एंड ड्रग डिलिवरी (रिब्बडीडी) और साइमन होगनर्स फैमिली फाउंडेशन पर लुंडबेक फाउंडेशन रिसर्च इनिशिएटिव से फंडिंग को स्वीकार करना चाहते हैं ।
Materials
| ATP | Tocris | 3245 | |
| Cal-520 AM | AAT Bioquest | 21130 | |
| Cell incubator | Thermo Fisher | ||
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Multifuge 3SR+ | Standard large volume centrifuge for spinning down cells |
| Collagen IV | Sigma Aldrich | C5533 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl Zeiss | Zeiss LSM 510 | Inverted microscope |
| Counting chamber | FastRead | 102 | |
| Coverslip cell chamber | Airekacells | SC15022 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | C5135 | Formerly known as Kolliphor EL |
| DMSO | Sigma Aldrich | 471267 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium | Sigma Aldrich | D0819 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAA/GE Healthcare | A15-101 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fisher | F1201 | |
| Glass coverslips 22×22 mm | VWR International | 631-0123 | |
| HBSS | Gibco | 14065-049 | |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| HEPES | AppliChem Panreac | A1069 | |
| Light microscope | Olympus | Olympus CK2 | Upright light microscope with phase contrast |
| MEM nonessential amino acids | Sigma Aldrich | M7145 | |
| Microplate Reader | BMG LabTech | NOVOstar | |
| PBS | Sigma Aldrich | D8537 | Phosphate-buffered saline |
| penicillin G sodium/streptomycin sulfate | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Pluronic F127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4299 | |
| T-75 flask | Sigma Aldrich | CLS3972 | |
| 96-well plate | Corning incorporated | 3603 |
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