Målet med denna artikel är att tillhandahålla ett standardiserat tillvägagångssätt för att inducera mänskliga lever stamceller differentiering från pluripotenta stamceller. Utvecklingen av detta förfarande med färdiga medieformuleringar erbjuder användaren ett enkelt system för att generera mänskliga leverceller för biomedicinsk forskning och översättning.
Leversjukdom är en eskalerande global hälsofråga. Medan levertransplantation är ett effektivt behandlingssätt, har patientdödligheten ökat på grund av brist på donatororgantillgänglighet. Organbrist påverkar också den rutinmässiga tillgången på mänskliga hepatocyter för grundforskning och kliniken. Därför är utvecklingen av förnybara källor till mänskliga lever stamceller önskvärd och är målet för denna studie. För att effektivt kunna generera och distribuera mänskliga lever avkomma i stor skala, utvecklades ett reproducerbart lever stamceller differentieringssystem. Detta protokoll underlättar experimentell reproducerbarhet mellan användare i en rad cellkulturprogram format och tillåter differentiering med hjälp av både, mänskliga embryonala och inducerad pluripotent stamcellslinjer. Dessa är viktiga fördelar jämfört med nuvarande differentieringssystem som kommer att förbättra grundforskningen och kan bana väg för klinisk produktutveckling.
Leversjukdom utgör en global hälsoutmaning som orsakar cirka 2 miljoner dödsfall per år över hela världen1. Även om det finns ett antal modellsystem för att studera leversjukdomar och ingripa kliniskt, begränsas den rutinmässiga användningen av cellbaserade system av betydande nackdelar (för en översyn se Szkolnicka et al.2). Avancerad human pluripotent stamcellskultur (hPSC) och somatiska celldifferentieringsmetoder representerar lovande teknik för att utveckla verktyg för grundläggande biomedicinsk forskning och förnybara källor till differentierade celler förkliniken 3,4.
Hittills har flera protokoll för hepatocytliknande cell (HLC) differentiering utvecklats5,6,7,8. Dessa protokoll försöker återskapa aspekter av mänsklig leverutveckling genom att använda en kombination av små molekyler ochtillväxtfaktorer 9,10. De flesta protokoll består av en stegvis differentieringsprocess, där hPSCs är primade till slutgiltig endoderm, följt av lever stamceller specifikation11,12,13, och slutar med HLC-specifikation. HLCs som produceras av dessa protokoll visar en blandning av fetala och vuxna fenotyper. Detta inkluderar uttryck av alfa fetoprotein (AFP), såsom hepatocyt markörer såsom HNF4α och albumin (ALB), samt drogmetaboliserandekapacitet 14,15,16. Mellan laboratorier kan HLC-differentiering variera; Därför är utvecklingen av standardiserade protokoll nödvändig. Detta kommer att göra det möjligt för forskare att effektivt generera och tillämpa stamcellsbaserade HLCs i stor skala för grundläggande och klinisk forskning.
Ett lever stamceller differentieringssystem utvecklades som kan tillämpas på både mänskliga embryonala och inducerad pluripotenta stamcellslinjer med hjälp av lätt att följa riktlinjer. Detta förfarande ger homogena populationer av lever avkomma i olika odlingsmaterialformat, allt från cellodlingsflaskor till 96 brunnsplattor. Nedan följer protokollet för att producera stamcellsbaserade leverprogenitorer i 24 och 96 brunnsformat.
Celltäthet som används i det protokoll som presenteras nedan anges för en brunn på en 24 respektive 96 brunnsplatta (se tabell 1). Optimering av startcellsnumret krävs för de olika cellkulturplåtformaten och cellinjerna. Föreslagen startcellsdensitet för protokolloptimering är 2 x 105 celler/cm2. För densitetsoptimering kan flera celltätheter testas genom att lägga till ± 50 000 celler/cm2 åt gången.
Genereringen av mänskliga lever stamceller från pluripotenta stamceller i stor skala kan utgöra ett lovande alternativ till kadaver-härledda material. Protokollstandardisering och reproducerbarhet är nyckeln till att säkerställa tekniköversättning och påverkan för biomedicinsk forskning. För att ta itu med detta har tidigare arbete fokuserat på att utveckla ett stegvis differentieringsprotokoll från hESC och iPSCs med hjälp av definierade tillsatser ochmatriser 15,23,24,25,26,27,28. Genom att göra detta har hepatocyt fenotyp och reproducerbarhet förbättrats, vilket möjliggör halvautomatisering av differentieringsprocessen19. Systemet som presenteras förstärks av sin kombination med off-the-shelf cell kultur media och ett facile hepatocyte differentieringssystem.
Tidigare lyftes pluripotent celltäthet före början av differentiering protokollet som en viktig variabel för att uppnå en homogen population av lever stamceller26. Med hjälp av detta mer raffinerade förfarande är det möjligt att generera ett stort antal stamcellsbaserade leverprogenitorer stegvis med hjälp av ett intervall av startcellstätheter (tabell 1). Dag 5 validerades den definitiva induktionen av endoderm genom Sox17-färgning (figur 3). Effektiv och robust differentiering till definitiv endoderm uppnåddes med både testade ESC- och iPSC-linjer, där mer än 80 % uttryckte Sox17 (figur 3). Dag 10 uppvisade leverprogenitorer en enhetlig kullerstensliknande morfologi, och leverstamcellsmarkörer var mycket berikade för både AFP och HNF4α (>86%, figur 4). Med hjälp av en kombination av manuell och halvautomatisk teknik var det möjligt att utföra differentiering i flera plåtformat19.
I sin nuvarande form är cell differentiering lämplig för in vitro-baserade experiment. Cellberikning skulle dock sannolikt krävas före klinisk applicering för att säkerställa att en homogen population av leverprogenitorer förbereds för leverans.
Sammanfattningsvis ger protokollet som beskrivs här fältet ett standardiserat tillvägagångssätt för att producera leveravkommor i stor skala. Framtida arbete kommer att fokusera på produktion av ett nytt medium för efterföljande HLC-differentiering, mognad och underhåll.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes med utmärkelser från MRC Doctoral Training Partnership (MR/K501293/1), UK Regenerative Medicine Platform (MRC MR/L022974/1 och MR/K026666/1), Chief Scientist Office (TCS/16/37).
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent | thermofisher | R37165 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Endoderm Basal Medium | STEMCELL Technologies | ||
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium | STEMCELL Technologies | ||
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Sigma-Aldrich | A8452 | 1:400 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Sox17 | R&D Systems, Inc. | AF1924 | 1:200 (Goat) |
Software | |||
Columbus Image Data Storage and Analysis system | PerkinElmer |