Ikke-radioaktiv analyse til måling af polynukleotid phosphorylation af små nukleotid substrater
Summary
Denne protokol beskriver en ikke-radioaktiv analyse til måling af kinase aktivitet af polynukleotidkinaser (PNKs) på små DNA- og RNA-substrater.
Abstract
Polynukleotidkinaser (PNKs) er enzymer, der katalyserer fosforyleringen af 5′ hydroxylenden af DNA og RNA oligonukleotider. PNKs’ aktivitet kan kvantificeres ved hjælp af direkte eller indirekte tilgange. Præsenteret her er en direkte, in vitro tilgang til at måle PNK aktivitet, der bygger på en fluorescerende mærket oligonukleotid substrat og polyacryamide gel elektroforese. Denne fremgangsmåde giver opløsning af fosforylerede produkter og samtidig undgå brugen af radioaktivt mærkede substrater. Protokollen beskriver, hvordan fosforyleringsreaktionen skal opsættes, forberede og køre store polyacryamidgeler og kvantificere reaktionsprodukterne. Den mest teknisk udfordrende del af denne analyse er at hælde og køre de store polyacryamid geler; der gives derfor vigtige detaljer for at overvinde fælles vanskeligheder. Denne protokol blev optimeret til Grc3, en PNK, der samler sig i et forpligtende præ-ribosomal RNA-behandlingskompleks med sin bindende partner, Las1-nukleasen. Denne protokol kan dog tilpasses til måling af andre PNK-enzymers aktivitet. Desuden kan denne analyse også ændres for at bestemme virkningerne af forskellige komponenter i reaktionen, såsom nukleosidens trefat, metalioner og oligonukleotider.
Introduction
Polynukleotidkinider (PNK) spiller en afgørende rolle i mange DNA- og RNA-behandlingsveje, såsom DNA-reparation og ribosomsamling1,2,,3,4,5. Disse grundlæggende enzymer katalyserer overførslen af terminalen (gamma) monofosfat fra en nukleosid tripfosfat (NTP, oftest ATP) til 5 ‘ hydroxyl ende af et nukleotid substrat. En af de mest vel karakteriseret PNKs er bakteriofage T4 PNK, som har bred substrat specificitet og er stærkt udnyttet af molekylærbiologi labs til at indarbejde radioaktive isotop etiketter på 5 endestation af en DNA eller RNA substrat6,7,8,9,10,11,12. Et andet eksempel på en PNK enzym er CLP1, som findes i Eukarya, Eubacteria, og Archaea, og er involveret i flere RNA behandling veje4,13,14,15.
Historisk set er de fleste analyser, der måler polynukleotid kinase aktivitet er afhængige af radioaktiv isotop mærkning og efterfølgende autoradiografi5,16. I de senere år er der udviklet en række yderligere analyser til måling af PNK-aktivitet, herunder enkeltmolekyle tilgange, mikrochip elektroforese, molekylære beacons, samt kolortrimetriske og luminescens-baserede analyser17,18,19,20,21,22. Mens mange af disse nye tilgange giver forbedret detektion grænser og undgå brugen af radioaktivitet, hver har ulemper, såsom omkostninger, afhængighed af immobiliseret harpiks, og begrænsninger i substrat valg.
Grc3 er en polynukleotid kinase , der spiller en central rolle i behandlingen af præ-ribosomal RNA2,3,23. Grc3 danner et obligate kompleks med endoribonuclease Las1, som kløver den interne transskriberede Spacer 2 (ITS2) af pre-ribosomal RNA3. Spaltning af ITS2 af Las1 genererer et produkt, der huser en 5 ‘ hydroxyl, der efterfølgende fosforyleret af Grc3 kinase3. For at undersøge nukleotid og substrat specificitet af Grc3, en billig analyse, der tillod test af forskellige oligonukleotid substrater var påkrævet. Derfor blev der udviklet en PNK-fosforyleringsanalyse ved hjælp af fluorescerende mærkede underlag. Denne analyse blev med succes brugt til at bestemme, at Grc3 kan udnytte enhver NTP for fosforyl overførsel aktivitet, men favoriserer ATP24. Denne protokol tilpasser den oprindelige analyse til at måle PNK aktivitet Grc3 på en RNA efterligne af sin præ-ribosomal RNA substrat (SC-ITS2, Tabel 1). Et udfordrende aspekt af denne fluorescens-baserede tilgang er afhængigheden af store polyarylamid geler til effektivt at løse fosforylerede og ikke-fosforede substrater. Protokollen indeholder specifikke detaljer om, hvordan man hælder disse store geler og undgå almindelige faldgruber, når du gør det.
Arbejde med RNA kræver særlig omhu, fordi det er stærkt modtagelige for nedbrydning. Der er enkle forebyggende skridt man kan tage for at begrænse ribonuclease forurening. En separat RNA-arbejdsstation, der let kan behandles med et RNase-inhibitor-holdige rengøringsmiddel, er ofte nyttig. Det er altid nødvendigt at bære handsker ved håndtering af prøver og brug af RNase-fri certificerede forbrugsstoffer. Da vand er en anden almindelig forureningskilde, er det bedst at bruge frisk renset vand og sterilisere alle opløsninger ved hjælp af et 0,22 μm filter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet er en analyse til at måle kinase aktivitet Grc3 PNK på fluorescerende mærket nukleotid substrater. Denne protokol kan anvendes til at karakterisere andre PNK enzymer ved at tilpasse reaction buffer og oligonucleotid substrat. F.eks. kræver protokollen en sporingsmængde af EDTA. Tilføjelsen af EDTA er gavnlig af to grunde: For det første favoriserer denne tilgang magnesiumbundet Grc3 ved at forhindre enzymet i at binde sig til at spore mængder af forurenende metaller i blandingen. For det andet hæmmer e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Andrew Sikkema og Andrea Kaminski for deres kritiske læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af US National Institute of Health Intramural Research Program; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 til R.E.S) og canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 til M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
