फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन ट्रांसजेनिक कैल्शियम रिपोर्टर Aequorin का उपयोग करने के लिए कैल्शियम सिग्नलिंग में उपन्यास लक्ष्य की पहचान
Summary
एक पढ़ने के रूप में Ca2 + ऊंचाई पर आधारित एक आगे आनुवंशिक स्क्रीन पौधों में कैल्शियम निर्भर सिग्नलिंग रास्तों में शामिल आनुवंशिक घटकों की पहचान की ओर जाता है ।
Abstract
फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन कई जैविक रास्तों में शामिल आनुवंशिक घटकों की निष्पक्ष पहचान में महत्वपूर्ण उपकरण रहे हैं । स्क्रीन का आधार एक उत्परिवर्ती आबादी उत्पन्न करना है जिसे ब्याज के फेनोटाइप के साथ जांचा जा सकता है। ईएमएस (एथिल मीथेन सल्फोनेट) किसी भी प्रक्रिया में शामिल कई जीन की पहचान करने के लिए शास्त्रीय फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में यादृच्छिक उत्परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला एल्किलाटिंग एजेंट है। साइटोसोलिक कैल्शियम (सीए2 +)ऊंचाई एक प्रमुख प्रारंभिक संकेत मार्ग है जो तनाव धारणा पर सक्रिय होता है। हालांकि रिसेप्टर्स, चैनलों, पंपों और Ca2 + के ट्रांसपोर्टरों की पहचान अभी भी कई अध्ययन प्रणालियों में मायावी है । Aequorin एक सेलुलर कैल्शियम रिपोर्टर प्रोटीन Aequorea विक्टोरिया से अलग है और stably अरबीडोप्सिस में व्यक्त किया है । इसका शोषण करते हुए, हमने एक फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन तैयार की जिसमें हमने ईएमएस-म्यूटेजेनाइज्ड एटोरिन ट्रांसजेनिक को डिजाइन किया। उत्परिवर्ती पौधों से बीज एकत्र किए गए (एम1)और अलग (एम2) आबादीमें ब्याज की फेनोटाइप के लिए स्क्रीनिंग की गई थी। 96-अच्छी तरह से उच्च-थ्रूपुट सीए2 + माप प्रोटोकॉल का उपयोग करके, कई उपन्यास म्यूटेंट की पहचान की जा सकती है जिनमें कैल्शियम की अलग-अलग प्रतिक्रिया होती है और वास्तविक समय में मापा जाता है। ब्याज के फेनोटाइप वाले म्यूटेंट को बचाया जाता है और तब तक प्रचारित किया जाता है जब तक कि एक होमोज़िगस उत्परिवर्ती पौधे की आबादी प्राप्त नहीं हो जाती है। यह प्रोटोकॉल Ca2+ रिपोर्टर पृष्ठभूमि में अग्रेषित आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक विधि प्रदान करता है और उपन्यास Ca2 + विनियमित लक्ष्यों की पहचान करता है।
Introduction
बायोटिक या अजैविक उत्तेजना की धारणा पर साइटोसोलिक कैल्शियम (सीए2 +)एकाग्रता में परिवर्तन एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया प्रारंभिक संकेत घटना है जो कई सिग्नलिंगरास्तों कोसक्रिय करती है 1 ,2,,,3,,4। इसके बेसल विश्राम राज्य में एक कोशिका साइटोसोल में कम सीए2 + एकाग्रता बनाए रखती है और विभिन्न इंट्रासेलुलर ऑर्गेनेल्स और एक्सट्रासेलुलर एपोप्लास्ट में अतिरिक्त सीए2 + को अलग रखती है जिससे खड़ी सीए2 + ढाल5,,6होती है। सिग्नल धारणा पर, एक्सट्रासेलुलर और/या इंट्रासेलुलर स्रोतों से सीए 2 + की आमद के कारण साइटोसोल में सीए 2+ का स्तर बढ़जाता है और एक,उत्तेजना विशिष्ट कैल्शियम हस्ताक्षर7,,8,9उत्पन्न करता है। साइटोसोल में सीए2 + ऊंचाई कई उत्तेजनाओं द्वारा सक्रिय होती है, लेकिन विशिष्टता सीए2 +,एक अद्वितीय सीए 2 + हस्ताक्षर और उपयुक्त सेंसर प्रोटीन10,,11को जारी करने वाले अलग-अलग स्टोर द्वारा बनाए रखी जाती है।2+
म्यूटेनेसिस के लिए एल्किलेटिंग एजेंट, एथिल-मीथेन सल्फोनेट (ईएमएस) का उपयोग शास्त्रीय फॉरवर्ड जेनेटिक स्क्रीन में एक शक्तिशाली उपकरण है जो एक प्रक्रिया में शामिल कई स्वतंत्र जीन की पहचान करता है। ईएमएस एक रासायनिक म्यूटाजेन मुख्य रूप से सी को टी और जी को जीनोम में बेतरतीब ढंग से संक्रमण के लिए प्रेरित करता है और जीनोम के हर 125 किलोब में 1 बीपी परिवर्तन पैदा करता है। ईएमएस म्यूटेनेसिस ≈१००० एकल आधार जोड़ी परिवर्तन, या तो प्रविष्टि/विलोपन (InDel) या एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (एसएनपी) प्रति जीनोम12प्रेरित करेगा । ईएमएस-प्रेरित उत्परिवर्तन 1/3000 से 1/30000 प्रति लोकस तक उत्परिवर्तन आवृत्ति के साथ कई बिंदु उत्परिवर्तन हैं। यह किसी दिए गए जीन में उत्परिवर्तन खोजने के लिए आवश्यक एम1 पौधों की संख्या को कम करता है। 2000-3000 की एम1 बीज जनसंख्या सीमा का उपयोग आमतौर पर अरबीडोप्सिस थैलियाना13 , 14,में ब्याज के उत्परिवर्तन प्राप्त करने के लिए कियाजाताहै।
एकोरिन ट्रांसजेनिक्स अरबीडोप्सिस कोलंबिया-0 (कर्नल-0) इकोटाइप पौधे हैं जो साइटोसोल15में p35S-apoaequorin (pMAQ2) व्यक्त करते हैं। Aequorin एक सीए2 + बाध्यकारी प्रोटीन है जो एपोप्रोटीन से बना है और एक कृत्रिम समूह है जिसमें लूसिफ़ेरिन अणु, कोएलेंटेरज़ीन शामिल हैं। सीए2 + से ऐकोरिन के लिए बाध्यकारी, जिसमें तीन सीए2 + बाध्यकारी ईएफ-हाथों की साइटें हैं, जिसके परिणामस्वरूप कोएलेंटेरज़ीन को डाइऑक्सेटोन इंटरमीडिएट देने के लिए ऑक्सीकृत और चक्रीय किया जा रहा है, जिसके बाद कार्बन डाइऑक्साइड और सिंगलेट-उत्साहित कोलेरेंटेरामाइड16की रिहाई के साथ प्रोटीन का एक अनुरूप परिवर्तन हुआ। इस प्रकार उत्पादित कोलेरेंटेमाइड एक नीली रोशनी (λअधिकतम,470 एनएम) उत्सर्जित करता है जिसका पता ल्यूमिनोमीटर17द्वारा लगाया जा सकता है। बेहद तेजी से Ca2 + ऊंचाई इस प्रकार वास्तविक समय में मापा जा सकता है, और तेजी से आगे आनुवंशिक स्क्रीन के लिए शोषण किया । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सीए2 + हस्ताक्षर में शामिल उपन्यास प्रमुख खिलाड़ियों की पहचान करने के लिए कैल्शियम प्रतिक्रिया की विशिष्टता का उपयोग करना है। इस कार्य को प्राप्त करने के लिए, हम ट्रांसजेनिक एकोरिन में ईएमएस म्यूटेनेसिस का उपयोग करते हैं और परिवर्तित सीए2 + सिग्नलिंग से जुड़े एस्प्स की पहचान करते हैं। प्रोटोकॉल म्यूटेंट की पहचान करता है जो उत्तेजनाओं के अलावा पर सीए2 + ऊंचाई नहीं दिखाते हैं। इसके बाद इन म्यूटेंट को सीए2 + प्रतिक्रिया के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करने के लिए मैप किया जा सकता है । यह विधि पौधों में किसी भी प्रकार की तरल उत्तेजनाओं पर लागू होती है जिसके परिणामस्वरूप सीए2 + ऊंचाई होती है। चूंकि सीए2 + ऊंचाई संयंत्र रक्षा सिग्नलिंग मार्ग में पहली प्रतिक्रियाओं में से एक है, इसलिए अपस्ट्रीम प्रतिक्रिया घटकों की पहचान लचीला पौधों को विकसित करने के लिए आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए उम्मीदवारों को प्रदान कर सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईएमएस म्यूटेनेसिस जनसंख्या में उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। ईएमएस का उपयोग कर शास्त्रीय आगे आनुवंशिक स्क्रीन दो प्रमुख कारणों के लिए उपंयास जीन की पहचान करने के लिए एक प्रभ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम राष्ट्रीय संयंत्र जीनोम अनुसंधान संस्थान-संयंत्र विकास के लिए फाइटोट्रॉन सुविधा, वीडियो शूट के लिए बॉम्बे लोकल और ई-संसाधनों तक पहुंच प्रदान करने के लिए जैव प्रौद्योगिकी विभाग-eLibrary कंसोर्टियम को धन्यवाद देते हैं । इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ प्लांट जीनोम रिसर्च कोर ग्रांट, मैक्स प्लैंक गेसेल्सचैफ्ट-इंडिया पार्टनर ग्रुप प्रोग्राम के माध्यम से बायोटेक्नोलॉजी विभाग, भारत द्वारा समर्थित किया गया था; और सीएसआईआर-जूनियर रिसर्च फेलोशिप (डीएम और एस.एम. और जैव प्रौद्योगिकी विभाग-जूनियर रिसर्च फैलोशिप (आर.पी.) ।
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
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