Forward Genetisch Scherm met behulp van transgene calcium Reporter Aequorin om nieuwe doelen te identificeren in calcium signalering
Summary
Een voorwaarts genetisch scherm op basis van Ca2 + hoogte als een read-out leidt tot de identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij calcium afhankelijke signalering trajecten in planten.
Abstract
Voorwaartse genetische schermen zijn belangrijke instrumenten geweest bij de onbevooroordeelde identificatie van genetische componenten die betrokken zijn bij verschillende biologische trajecten. De basis van het scherm is het genereren van een mutant populatie die kan worden gescreend met een fenotype van belang. EMS (ethylmethaansulfonaat) is een veelgebruikt alkylaatmiddel voor het induceren van willekeurige mutatie in een klassiek voorwaarts genetisch scherm om meerdere genen te identificeren die betrokken zijn bij een bepaald proces. Cytosolic calcium (Ca2 +) hoogte is een belangrijke vroege signalering traject dat wordt geactiveerd op stress perceptie. Maar de identiteit van receptoren, kanalen, pompen en transporters van Ca2 + is nog steeds ongrijpbaar in veel studiesystemen. Aequorin is een cellulair calcium reporter eiwit geïsoleerd van Aequorea victoria en stabiel uitgedrukt in Arabidopsis. Door dit te benutten, ontwierpen we een voorwaarts genetisch scherm waarin we ems-mutagenized de aequorine transgene. De zaden van de gemuteerde planten werden verzameld (M1) en screening op het fenotype van belang werd uitgevoerd in de segregatie (M2) populatie. Met behulp van een 96-well high-throughput Ca2+ meetprotocol kunnen verschillende nieuwe mutanten worden geïdentificeerd die een wisselende calciumrespons hebben en in realtime worden gemeten. De mutanten met het fenotype van belang worden gered en gepropageerd tot een homozygoot gemuteerde plantenpopulatie wordt verkregen. Dit protocol biedt een methode voor voorwaartse genetische schermen in Ca2 + reporter achtergrond en identificeren van nieuwe Ca2 + gereguleerde doelen.
Introduction
Een verandering in cytosolic calcium (Ca2+) concentratie op de perceptie van biotische of abiotische stimulus is een goed bestudeerde vroege signalering gebeurtenis die veel signalering trajectenactiveert 1,2,3,4. Een cel in zijn basale rusttoestand behoudt een lagere Ca2+ concentratie in de cytosol en sekwestreert overtollige Ca2+ in verschillende intracellulaire organellen en extracellulaire apoplast die leidt tot een steile Ca2+ hellingsgraad 5,6. Bij signaalperceptie stijgen ca2+ niveaus in de cytosol als gevolg van een toestroom van Ca2+ uit extracellulaire en/of intracellulaire bronnen en genereren ze een stimulispecifieke calciumsignatuur7,8,9. Ca2+ verhogingen in de cytosol worden geactiveerd door vele stimuli, maar de specificiteit wordt gehandhaafd door verschillende winkels die Ca2+vrijgeven, een unieke Ca2+ handtekening en geschikte sensoreiwitten10,11.
Het gebruik van alkylaatmiddel, ethyl-methaansulfonaat (EMS) voor mutagenesis is een krachtig hulpmiddel in klassieke voorwaartse genetische schermen om meerdere onafhankelijke genen te identificeren die betrokken zijn bij een proces. EMS is een chemische mutageen die voornamelijk C tot T en G naar A leidt, willekeurig door het genoom en produceert een verandering van 1 bp in elke 125 kb van het genoom. EMS mutagenesis zal leiden tot ≈1000 single base pair veranderingen, hetzij inbrengen / schrappingen (InDel) of single nucleotide polymorfisme (SNP) per genoom12. EMS-geïnduceerde mutaties zijn meervoudige puntmutaties met een mutatiefrequentie variërend van 1/300 tot 1/30000 per locus. Dit vermindert het aantal M1 planten die nodig zijn om een mutatie in een bepaald gen te vinden. Een M1 zaadpopulatie bereik van 2000-3000 wordt meestal gebruikt om mutaties van belang in Arabidopsis thaliana13,14te verkrijgen .
Aequorin transgenics zijn Arabidopsis Columbia-0 (Col-0) ecotype planten uitdrukken p35S-apoaequorin (pMAQ2) in de cytosol15. Aequorin is een Ca2+ bindend eiwit bestaande uit apoproteïne en een prothetische groep bestaande uit luciferine molecuul, coelenterazine. De binding van Ca2+ aan aequorin, dat drie Ca2+ bindende EF-hands sites heeft, resulteert in coelenterazine wordt geoxideerd en cyclized om de dioxetanon intermediair te geven, gevolgd door een conformatieverandering van het eiwit vergezeld van het vrijkomen van kooldioxide en singlet-opgewonden coelenteramide16. De aldus geproduceerde coelenteramide zendt een blauw licht (λmax, 470 nm) uit dat kan worden gedetecteerd door de luminometer17. De extreem snelle Ca2+ verhogingen kunnen dus in real time worden gemeten en worden benut voor snelle voorwaartse genetische schermen. Dit protocol is bedoeld om de specificiteit van calciumrespons te gebruiken om nieuwe belangrijke spelers te identificeren die betrokken zijn bij de Ca2+ handtekening. Om deze taak te volbrengen, gebruiken we EMS mutagenesis in transgene aequorine en identificeren we de SNPs die zijn gekoppeld aan gewijzigde Ca2+ signalering. Het protocol identificeert mutanten die geen of verminderde Ca2+ verhogingen vertonen bij toevoeging van stimuli. Deze mutanten kunnen vervolgens in kaart worden gebracht om de genen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de Ca2+ respons. De methode is van toepassing op elke vorm van vloeibare stimuli in planten die resulteert in een Ca2 + hoogte. Aangezien Ca2 + hoogte is een van de eerste reacties in de plant verdediging signalering traject, de identificatie van upstream respons componenten kunnen kandidaten voor genetische manipulatie om veerkrachtige planten te ontwikkelen.
Protocol
Representative Results
Discussion
EMS mutagenesis is een krachtig hulpmiddel om mutaties in de bevolking te genereren. De klassieke voorwaartse genetische schermen met EMS zijn een effectief instrument geweest om nieuwe genen te identificeren om twee belangrijke redenen: ten eerste vereisen ze geen eerdere veronderstellingen over de genidentiteit en ten tweede introduceren ze geen vooringenomenheid. Er zijn verschillende methoden om een screening populaties zoals EMS, T-DNA inserties, straling etc. genereren. Van alle methoden heeft ems-gebaseerde mutage…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken National Institute of Plant Genome Research – Phytotron Facility voor plantengroei, Bombay Locale voor de videoshoot, en het Department of Biotechnology- eLibrary Consortium voor het verstrekken van toegang tot e-resources. Dit werk werd ondersteund door het Department of Biotechnology, India via het National Institute of Plant Genome Research Core Grant, Max Planck Gesellschaft-India Partner Group program; en CSIR-Junior Research Fellowship (aan D.M. en S.M) en Department of Biotechnology-Junior Research Fellowship (naar R.P).
Materials
| 24 well tissue culture plate | Jetbiofil | 11024 | for growing seedlings |
| 96 well white cliniplate | Thermo Scientific | 9502887 | for luminometer measurements |
| Aequorin | |||
| Agropet | Lab Chem India | for plant growth | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 12135 | for discharge solution |
| Coelenterazine | PJK | 55779-48-1 | prosthetic group for aequorin |
| Ehtylmethane sulfonate | Sigma Aldrich | M0880-5G | for seed mutagenesis |
| Ethanol | Analytical reagent | 1170 | for discharge solution |
| Hydrochloric acid | Merck Life Sciences | 1.93001.0521 | sterlization solution |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | 15465 | as stimulus for Calcium elevation |
| Luminoskan ascent | Thermo Scientific | 5300172 | aequorin luminescence measurement |
| MES buffer | Himedia | RM1128-100G | plant growth |
| Murashige and skoog media | Himedia | PT021-25L | plant growth |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 27805 | for neutralizing EMS |
| Sodium hypochlorite | Merck Life Sciences | 1.93607.5021 | sterlization solution |
| Sodium thiosulfate | Fisher Scientific | 28005 | for seed washing in step 1.6 |
| soilrite | Lab Chem India | for plant growth | |
| Square pots | Lab Chem India | for plant growth | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S0389 | plant growth |
| Taxim | Alkem | 7180720 | for seedling rescue |
References
- Kudla, J., Batistic, O., Hashimoto, K. Calcium signals: The lead currency of plant information processing. The Plant Cell. 22 (3), 541-563 (2010).
- Wasternack, C., Hause, B. Jasmonates: biosynthesis, perception, signal transduction and action in plant stress response, growth and development. An update to the 2007 review in Annals of Botany. Annals of Botany. 111 (6), 1021-1058 (2013).
- Kiep, V., et al. Systemic cytosolic Ca2+ elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytologist. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Zhu, X., et al. Aequorin-based Luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Molecular Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- White, P. J., Broadley, M. R. Calcium in plants. Annals of Botany. 92, 487-511 (2003).
- Johnson, J. M., Reichelt, M., Vadassery, J., Gershenzon, J., Oelmueller, R. An Arabidopsis mutant impaired in intracellular calcium elevation is sensitive to biotic and abiotic stress. BMC Plant Biology. 14 (1), 162 (2014).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annual Review of Plant Biology. 61, 593-620 (2010).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. The Plant Journal. 68 (1), 100-113 (2011).
- Downie, J. A. Calcium signals in plant immunity: a spiky issue. New Phytologist. 204 (4), 733-735 (2014).
- Marcec, M. J., Gliroy, S., Poovaiah, B. W., Tanaka, K. Mutual interplay of Ca2+ and ROS signaling in plant immune response. Plant Science. 283, 343-354 (2019).
- McAnish, M. R., Pittman, J. K. Shaping the calcium signature. New Phytologist. 181, 275-294 (2009).
- Colbert, T., et al. High -throughput screening for induced point mutations. Plant Physiology. 126 (2), 480-484 (2001).
- Koornneef, M., Gilmartin, P. M., Bowler, C., Oxford, G. B. Classical mutagenesis in higher plants. Molecular Plant Biology. , 1-10 (2002).
- Page, D., Grossniklaus, U. The art and design of genetic screens: Arabidopsis thaliana. Nature Reviews Genetics. 3 (2), 124-136 (2002).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Tanaka, K., Choi, J., Stacey, G., Running, M. Aequorin Luminescence-Based Functional Calcium Assay for Heterotrimeric G-Proteins in Arabidopsis. G Protein-Coupled Receptor Signaling in Plants. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). , 45-54 (2013).
- Mithöfer, A., Ebel, J., Bhagwat, A. A., Boller, T., Neuhaus-Url, G. Transgenic aequorin monitors cytosolic calcium transients in soybean cells challenged with beta-glucan or chitin elicitors. Planta. 207 (4), 566-574 (1999).
- Arisha, M. H., et al. Ethyl methane sulfonate induced mutations in M2 generation and physiological variations in M1 generation of peppers (Capsicum annuum L.). Frontiers in Plant Science. 6, 399 (2015).
- Ranf, S., et al. Defense-related calcium signaling mutants uncovered via a quantitative high-throughput screen in Arabidopsis thaliana. Molecular Plant. 5 (1), 115-130 (2012).
- Rentel, M. C., Knight, M. R. Oxidative stress-induced calcium signalling in Arabidopsis. Plant Physiology. 135 (3), 1471-1479 (2004).
- Jankowicz-Cieslak, J., Till, B. J. Chemical mutagenesis of seed and vegetatively propagated plants using EMS. Current Protocols in Plant Biology. 1 (4), 617-635 (2016).
- Espina, M. J., et al. Development and Phenotypic Screening of an Ethyl Methane Sulfonate Mutant Population in Soybean. Frontiers in Plant Science. 9, 394 (2018).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Forward Genetics in Arabidopsis: Finding Mutations that Cause Particular Phenotypes. Cold Spring Harbor Protocols. 5, (2006).
- Maple, J., Moeller, S. G., Rosato, E. Mutagenesis in Arabidopsis. Circadian Rhythms. Methods in Molecular Biology. , 362 (2007).
- Qu, L. J., Qin, G., Sanchez-Serrano, J., Salinas, J. Generation and Identification of Arabidopsis EMS Mutants. Arabidopsis Protocols, Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 1062, (2014).
- Leyser, H. M. O., Furner, I. J., Flanders, D., Dean, C. EMS Mutagenesis of Arabidopsis. Arabidopsis: the Complete Guide (Electronic v. 1.4). , 9-10 (1993).
- Pauly, N., et al. The nucleus together with the cytosol generates patterns of specific cellular calcium signatures in tobacco suspension culture cells. Cell Calcium. 30 (6), 413-421 (2001).
- Mithöfer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biological Procedures Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Mehlmer, N., et al. A toolset of aequorin expression vectors for in planta studies of subcellular calcium concentrations in Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1751-1761 (2012).
- Knight, H., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Cold calcium signaling in Arabidopsis involves two cellular pools and a change in calcium signatures after acclimation. The Plant Cell. 8, 489-503 (1996).
- Sello, S., et al. Chloroplast Ca2+ fluxes into and across thylakoids revealed by thylakoid-targeted aequorin probes. Plant Physiology. 177 (1), 38-51 (2018).
- Frank, J., et al. Chloroplast-localized BICAT proteins shape stromal calcium signals and are required for efficient photosynthesis. New Phytologist. 221 (2), 866-880 (2019).
- Choi, J., et al. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Yuan, F., et al. OSCA1 mediates osmotic-stress-evoked Ca2+ increases vital for osmosensing in Arabidopsis. Nature. 514 (7522), 367-371 (2014).
- Ranf, S., et al. A lectin S-domain receptor kinase mediates lipopolysaccharide sensing in Arabidopsis thaliana. Nature Immunology. 16 (4), 426-433 (2015).
- Johnson, J. M., et al. A Poly(A) Ribonuclease Controls the Cellotriose-Based Interaction between Piriformospora indica and Its Host Arabidopsis. Plant Physiology. 176 (3), 2496-2514 (2018).
- Wu, F., et al. Hydrogen peroxide sensor HPCA1 is an LRR receptor kinase in Arabidopsis. Nature. 578, 577-581 (2020).
