Denne protokol fungerer som en omfattende tutorial til standardiseret og reproducerbar blanding af viskøse materialer med en ny open source-automatiseringsteknologi. Der gives detaljerede instruktioner om driften af en nyudviklet open source-arbejdsstation, brugen af en open source-protokoldesigner og validering og verifikation for at identificere reproducerbare blandinger.
Nuværende blandingstrin af viskøse materialer er afhængige af gentagne og tidskrævende opgaver, der hovedsageligt udføres manuelt i en tilstand med lav gennemstrømning. Disse problemer repræsenterer ulemper i arbejdsgange, der i sidste ende kan resultere i irreproducerbarhed af forskningsresultater. Manuelt baserede arbejdsgange begrænser yderligere fremskridt og udbredt vedtagelse af viskøse materialer, såsom hydrogeler, der anvendes til biomedicinske applikationer. Disse udfordringer kan overvindes ved at bruge automatiserede arbejdsgange med standardiserede blandingsprocesser for at øge reproducerbarheden. I denne undersøgelse præsenterer vi trinvise instruktioner til at bruge en open source-protokoldesigner, til at drive en open source-arbejdsstation og til at identificere reproducerbare blandinger. Specifikt guider open source-protokoldesigneren brugeren gennem det eksperimentelle parametervalg og genererer en klar til brug protokolkode til betjening af arbejdsstationen. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af viskøse materialer for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra pipettespidsen. Validering og verifikation af blandinger udføres ved en hurtig og billig absorbensmåling af Orange G. Denne protokol præsenterer resultater for at opnå 80% (v / v) glycerolblandinger, en fortyndingsserie for gelatinemethacyloyl (GelMA) og dobbeltnetværkshydrogeler på 5% (w / v) GelMA og 2% (w / v) alginat. Der medfølger en fejlfindingsvejledning, der hjælper brugerne med at vedtage protokoller. Den beskrevne arbejdsgang kan anvendes bredt på en række viskøse materialer for at generere brugerdefinerede koncentrationer på en automatiseret måde.
Reproducerbarhed og replikabilitet er af afgørende betydning i videnskabeligt arbejde1,2,3,4. Nylige beviser har imidlertid fremhævet betydelige udfordringer med at gentage biomedicinske undersøgelser med stor effekt inden for grundlæggende videnskab såvel som translationel forskning4,5,6,7. Faktorer, der bidrager til irreproducerbare resultater, er komplekse og mangfoldige, såsom dårligt eller forudindtaget undersøgelsesdesign6,8, utilstrækkelig statistisk effekt3,9, manglende overholdelse af rapporteringsstandarder7,10,11, pres for at offentliggøre6 eller utilgængelige metoder eller softwarekode6,9 . Blandt dem er subtile ændringer i protokollen og menneskelige fejl i udførelsen af eksperimenter blevet identificeret som yderligere elementer, der tegner sig for irreproducerbarhed4. F.eks. indfører manuelle pipetteringsopgaver intra- og interpersonlig unøjagtighed12,13 og øger sandsynligheden for menneskelige fejl14. Mens kommercielle væskehåndteringsrobotter er i stand til at overvinde disse ulemper og har vist øget pålidelighed for væsker15,16,17, er automatiseret håndtering af materialer med betydelige viskøse egenskaber stadig udfordrende.
Kommercielle væskehåndteringsrobotter bruger almindeligvis luftpudepipetter, også kendt som luftstempel eller luftfortrængningspipetter. Reagenset og stemplet adskilles af en luftpude, der krymper under dispenseringstrin og udvider sig under aspirerende trin. Ved hjælp af luftpudepipetter ‘flyder’ viskøse materialer kun langsomt ind og ud af spidsen, og tidlig tilbagetrækning af pipetten fra reservoiret kan resultere i aspiration af luftbobler. Under dispenseringsopgaver efterlader det tyktflydende materiale en film på den indvendige spidsvæg, som kun ‘flyder’ langsomt eller slet ikke, når det tvinges af luft. For at overvinde disse problemer blev positive forskydningspipetter introduceret kommercielt for aktivt at ekstrudere det viskøse materiale ud af spidsen ved hjælp af et solidt stempel. Selv om disse positive fortrængningspipetter muliggør nøjagtig og pålidelig håndtering af viskøse materialer, er automatiserede løsninger med positive fortrængningspipetter stadig for dyre til akademiske laboratorieindstillinger, og derfor er de fleste arbejdsgange med tyktflydende materialer udelukkende afhængige af manuelle pipetteringsopgaver18.
Generelt defineres viskositet som en væskes modstandsdygtighed over for strømning, og viskøse materialer defineres yderligere som materialer med større viskositet af vand (0,89 mPa·s ved 25 °C). Inden for biomedicinske anvendelser indeholder eksperimentelle opsætninger ofte flere materialer med en større viskositet end vand, såsom dimethylsulfoxid (DMSO; 1,99 mPa·s ved 25 °C), glycerol (208,1 mPa·s ved 25 °C for 90 % glycerol [v/v]), Triton X-100 (240 mPa·s ved 25 °C) og vandsvulmede polymerer, benævnt hydrogeler19 20. Hydrogeler er hydrofile polymernetværk arrangeret i en fysisk eller / og kemisk tilstand, der anvendes til forskellige anvendelser, herunder celleindkapsling, lægemiddelafgivelse og bløde aktuatorer19,20,21,22. Hydrogelernes viskositet afhænger af polymerkoncentrationen og molekylvægten19. Rutinemæssigt anvendte hydrogeler til biomedicinske anvendelser udviser viskositetsværdier mellem 1 og 1000 mPa·s, mens specifikke hydrogelsystemer er blevet rapporteret med værdier på op til 6 x 107 mPa·s19,23,24. Viskositetsmålinger af hydrogeler er imidlertid ikke standardiseret med hensyn til måleprotokol og prøveforberedelse, og derfor er viskositetsværdier mellem forskellige undersøgelser vanskelige at sammenligne.
Da kommercielt tilgængelige automatiserede løsninger, der er specielt designet til hydrogeler, enten mangler eller er for dyre, afhænger de nuværende arbejdsgange for hydrogel af manuel håndtering18. For at forstå begrænsningerne i den nuværende manuelle arbejdsgang for pipettering af hydrogeler er det vigtigt at forstå vigtige håndteringsopgaver18. For eksempel, når et nyt hydrogelmateriale er blevet syntetiseret, genereres en ønsket koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer for at identificere pålidelige synteseprotokoller og tværbindingsegenskaber med efterfølgende analyse af de mekaniske egenskaber25,26,27,28 . Generelt fremstilles eller købes en stamopløsning og blandes derefter med et fortyndingsmiddel og/eller andre reagenser for at opnå en blanding. Blandingsopgaverne udføres for det meste ikke direkte i en brøndplade (eller noget outputformat) og udføres snarere i et separat reaktionsrør, der almindeligvis betegnes som mastermix. Under disse forberedelsesopgaver kræves forskellige aspirerings- og dispenseringstrin for at overføre det eller de viskøse materialer, blande reagenserne og overføre blandingen til et udgangsformat (f.eks. En 96 brøndplade). Disse opgaver kræver en stor mængde menneskeligt arbejde18, lange eksperimentelle timer og øger sandsynligheden for menneskelige fejl, der potentielt kan manifestere sig som unøjagtige resultater. Desuden forhindrer manuel håndtering effektiv forberedelse af høje prøvenumre til at screene forskellige parameterkombinationer for detaljeret karakterisering. Den manuelle behandling hindrer også brugen af hydrogeler til screeningsapplikationer med høj kapacitet, såsom identifikation af lovende forbindelser under lægemiddeludvikling. De nuværende manuelle forberedelsestrin er ikke mulige at screene lægemiddelbiblioteker, der består af tusindvis af lægemidler. Af disse grunde er automatiserede løsninger nødvendige for at tilvejebringe en effektiv udviklingsproces og muliggøre en vellykket oversættelse af hydrogeler til lægemiddelscreeningsapplikationer.
For at gå fra manuelt baserede arbejdsgange til automatiserede processer har vi optimeret en kommerciel open source-pipetteringsrobot til håndtering af viskøse materialer ved at integrere temperaturdokker til termoresponsive materialer, brugen af hylden positive fortrængningspipetter ved hjælp af kapillære stempelspidser og en valgfri tipberøringsdock til rengøring af pipettespidser. Denne pipetteringsrobot er blevet yderligere integreret som pipetteringsmodul i en nyudviklet open source-arbejdsstation, som består af moduler, der er klar til installation og kan tilpasses18,29. Detaljerede monteringsinstruktioner til den udviklede arbejdsstation, herunder hardware- og softwarefiler, er frit tilgængelige fra GitHub (https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) og Zenodo-lageret (https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757). Ud over hardwareudviklingen er en open source-protokoldesignapplikation blevet programmeret og frigivet til at guide brugeren gennem parametervalgsprocessen og generere en klar til brug protokolkode (https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp). Denne kode kører på den kommercielle open source pipetteringsrobot såvel som på den udviklede open source-arbejdsstation.
Heri gives en omfattende tutorial om driften af open source-arbejdsstationen til automatisering af blandingsopgaver for viskøse materialer (figur 1). De tutorial-specifikke protokoltrin kan udføres med den udviklede open source-arbejdsstation såvel som den kommercielle open source pipetteringsrobot. Understøttet af en internt udviklet open source-protokoldesignapplikation demonstreres automatiseret blanding og forberedelse af krævede koncentrationer for glycerol, gelatinemethacyloyl (GelMA) og alginat. Glycerol er valgt i denne vejledning, da den er godt karakteriseret30,31, den er billig og let tilgængelig, og derfor bruges den almindeligvis som viskøst referencemateriale til automatiserede pipetteringsopgaver. Som eksempler på hydrogeler, der anvendes i biomedicinske anvendelser, er GelMA og alginathydrogelprækursoropløsninger blevet anvendt til automatiserede blandingsforsøg. GelMA præsenterer en af de mest almindeligt anvendte hydrogeler til celleindkapslingsundersøgelser32,33, og alginat blev udvalgt i denne undersøgelse for at demonstrere evnen til at fremstille dobbeltnetværkshydrogeler34,35. Ved hjælp af Orange G som farvestof blev der implementeret en hurtig og billig procedure for at validere og verificere blandingsresultaterne med et spektrofotometer16.
En kommerciel open source pipetteringsrobot er blevet integreret som pipetteringsmodul i den udviklede open source-arbejdsstation (figur 2a), og derfor bruges navnet ‘pipetteringsmodul’ yderligere til at beskrive pipetteringsrobotten. En detaljeret beskrivelse af den installerede hardware ligger uden for denne protokols anvendelsesområde og er tilgængelig via de medfølgende lagre, som også indeholder trinvise instruktioner til generalforsamlingen af open source-platformen. Pipetteringsmodulet kan udstyres med to pipetter (enkelt- eller 8-kanals pipette), som er monteret på akse A (højre) og akse B (venstre) (figur 2b). Pipetteringsmodulet tilbyder en kapacitet på 10 dæk i henhold til American National Standards Institute/Society for Laboratory Automation and Screening (ANSI/SLAS) standarder, og følgende placeringspositioner er defineret på dækket: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2 (figur 2c). For at starte fotoinduceret polymerisation af hydrogelopløsninger kræves et separat tværbindingsmodul og er blevet tilføjet til arbejdsstationen. Tværbindingsmodulet er udstyret med lysdioder med en bølgelængde på 400 nm, og derfor kan stoffer, der ophidser ved en synlig lysbølgelængde, anvendes med de nuværende systemer, såsom lithiumphenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP)36,37. Intensiteten (i mW/cm2) af lysdioderne kan adresseres af brugeren i protokoldesignapplikationen for at studere tværbindingsadfærden38. Arbejdsstationen indeholder også et lagermodul, der muliggør øgede gennemløbsundersøgelser; Dette modul anvendes imidlertid ikke i denne undersøgelse og er derfor ikke yderligere beskrevet. Generelt anbefales det at betjene pipetteringsmodulet i et biologisk sikkerhedsskab for at undgå prøvekontaminering. Det vigtigste strømkredsløb til betjening af pipetteringsmodulet er et 12 V kredsløb, der betragtes som en lavspændingsapplikation i de fleste lande. Alle elektriske komponenter er baseret på en dedikeret kontrolboks, der forhindrer brugere i at komme i kontakt med kilden til en elektrisk fare.
Ved at følge disse standardiserede blandingsprotokoller er forskere i stand til at opnå pålidelige blandinger til viskøse såvel som ikke-viskøse materialer på en automatiseret måde. Open source-tilgangen giver brugerne mulighed for at optimere blandingssekvenser og dele nyudviklede protokoller med samfundet. I sidste ende vil denne tilgang lette screeningen af flere parameterkombinationer for at undersøge den indbyrdes afhængighed mellem forskellige faktorer og dermed fremskynde den pålidelige anvendelse og udvikling af viskøse materialer til biomedicinske anvendelser.
Pipettering af viskøse materialer, især hydrogeler til biomedicinske anvendelser19,20,21,33,47, er rutinemæssige opgaver i mange forskningslaboratorier for at forberede en brugerdefineret koncentration eller en fortyndingsserie med varierende koncentrationer. Selvom det er gentagende, og udførelsen er ret enkel, udføres den for det meste manuelt med lav prøvegennemstrømning18. Denne vejledning introducerer driften af en open source-arbejdsstation, der er specielt designet til viskøse materialer, for at muliggøre automatiseret blanding af viskøse materialer til reproducerbar generering af ønskede koncentrationer. Denne arbejdsstation er optimeret til pipettering af hydrogeler for at muliggøre automatiseret og yderst pålidelig håndtering ved integration af temperaturdokker til termoresponsive materialer, positive forskydningspipetter til viskøse materialer og en valgfri tipberøringsdock for at fjerne overskydende materiale fra spidsen. Pipetteringsmodulet er specifikt optimeret til at muliggøre behandling af tyktflydende materiale på en standardiseret og automatiseret måde. Sammenlignet med luftpudepipetter (figur 5a) dispenserer positive fortrængningspipetter (figur 5b) viskøse materialer uden at efterlade restmateriale tilbage i spidsen, hvilket resulterer i nøjagtige aspirerings- og dispenseringsvolumener. Den valgfri spidsberøringsdock fjerner overskydende prøvemateriale fra spidsen (figur 5c,d), hvilket er nyttigt til limmaterialer (f.eks. 4% (w/v) alginat).
Protokoldesignerapplikationen er specielt programmeret til hydrogeler og tillader fortynding af op til fire reagenser med forskellige koncentrationer og op til to fortyndingsmidler. Risikoen for fejl i beregningen af endelige fortyndinger forhindres i denne applikation, da brugerne kun vælger den ønskede koncentration eller de serielle fortyndingstrin. Påkrævede aspirerings- og dispenseringsenheder beregnes automatisk, gemmes i en separat dokumentationstekstfil og udfyldes derefter i protokolscriptet. Denne protokoldesignapplikation giver brugeren fuld kontrol over alle eksperimentelle parametre (f.eks. Pipetteringshastighed) og sikrer intern dokumentation af de vigtige parametre. Protokoldesignappen tager højde for reservoirets påfyldningsniveau (f.eks. Brønd) og varierer aspirerings-/dispenseringshøjden for at forhindre unødvendig dypning i de viskøse materialer. Denne integrerede funktion undgår materialeakkumulering på spidsens ydervæg og sikrer derved pålidelige aspirerings- og dispenseringsopgaver i hele protokollen. Selvom protokoldesignerapplikationen er udviklet til hydrogelfortyndingstrin, kan den også bruges til fortynding af ikke-viskøse væsker, såsom Orange G-farvestoffer. Protokoldesignerapplikationen, som er tilgængelig via lageret under »/examples/publication-JoVE«, er den version, der forklares i protokolafsnittet og fremhæves i videoen. Denne version opdateres ikke. En opdateret version af protokoldesignerprogrammet er dog tilgængelig via hovedlagersiden. Kalibreringsterminalen blev oprindeligt udviklet af Sanderson48 og er optimeret til kalibrering af positive fortrængningspipetter.
Som beskrevet i protokolafsnit 4 skal pipetter såvel som beholdere kalibreres i første omgang. Denne kalibreringsproces er afgørende for at definere og gemme de positioner, som derefter bruges til at beregne bevægelsesintervallerne. Derfor er en vellykket protokoludførelse afhængig af veldefinerede kalibreringspositioner, da forkerte kalibreringspunkter kan resultere i, at spidsen styrter ned i en beholder. Da pipetternes stempelpositioner skal kalibreres manuelt, afhænger pipetteringsnøjagtigheden og -præcisionen i høj grad af den udførte kalibrering. Disse kalibreringsprocedurer afhænger i høj grad af brugeroplevelsen med pipetteringsmodulet, og derfor anbefales uddannelse med erfarent personale i begyndelsen for at sikre korrekte kalibreringsprocedurer. Ud over den manuelle kalibrering på pipetteringsmodulet skal selve pipetten kalibreres for at sikre nøjagtig pipettering. Det anbefales at kalibrere pipetterne mindst hver 12. måned for at opfylde acceptkriterierne som specificeret i ISO 8655. For at evaluere pipettekalibreringen internt er validering og verifikation tilgængelig som beskrevet af Stangegaard et al.16.
For at kunne frembringe et pålideligt datasæt er det afgørende at starte med reagenser af høj kvalitet. Dette er især vigtigt for hydrogelbehandlingsopgaver, da batch-til-batch-variationer kan påvirke de genererede resultater inden for denne protokol. Ud over batch-til-batch-variationer kan subtile ændringer i fremstillingen af små mængder også bidrage til egenskabsforskelle. For at forhindre dette anbefales fremstilling af større mængder, som kan bruges til hele forsøgene.
Validerings- og verifikationsprocedurerne er afhængige af brugen af et farvestof til at identificere pålidelige blandinger. Den præsenterede protokol beskriver anvendelsen af Orange G, men den generelle protokol- og analysearbejdsgang kan også tilpasses fluorescerende farvestoffer49,50. Brugen af Orange G reducerer spektrofotometerets tekniske krav og eliminerer forholdsregler, der træffes for at forhindre blegning af de fluorescerende farvestoffer efter udsættelse for lys. Problemer i opløsningsadfærd eller klyngedannelse af farvestoffet er ikke blevet observeret med de præsenterede materialer under forsøg, men kan forekomme med andre materialer. Potentiel klyngedannelse og dermed interaktionen mellem farvestof og materiale kunne let detekteres med et mikroskop.
De procedurer og teknikker, der præsenteres i denne vejledning, tilføjer automatiseringskapacitet til aktuelle arbejdsgange for viskøse materialer for at opnå meget pålidelige opgaver med minimal menneskelig arbejdskraft. Den medfølgende fejlfindingstabel (tabel 2) indeholder identificerede problemer og præsenterer mulige årsager samt løsninger til løsning af problemerne. Den præsenterede arbejdsstation er blevet anvendt med succes på naturlige (gelatine, gellangummi, matrigel) og syntetiske (f.eks. Poly(ethylenglycol) [PEG], Pluronic F127, Lutrol F127) polymere materialer til automatiserede pipetteringsopgaver. Især vil kombinationen af en open source-arbejdsstation og en open source-protokoldesignapplikation designet til viskøse materialer være meget nyttig for forskere, der arbejder inden for biomedicinsk teknik, materialevidenskab og mikrobiologi.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender medlemmerne af Center i Regenerativ Medicin ved QUT, især Antonia Horst og Pawel Mieszczanek for deres nyttige forslag og feedback. Dette arbejde blev støttet af QUT’s Postgraduate Research Award for SE og af Australian Research Council (ARC) under tilskudsaftale IC160100026 (ARC Industrial Transformation Training Centre in Additive Biomanufacturing). NB blev støttet af et National Health and Medical Research Council (NHMRC) Peter Doherty Early Career Research Fellowship (APP1091734).
15 reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-959-53A | |
5 mL tubes | Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (Australia) | SCT-5ML | size depends on experimentl protocol; also Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) or Falcon tubes (15, 50mL) can be used; product is manufactured by Axygen, Inc. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name |
50 mL reaction tubes | Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14-432-22 | |
70% w/w Ethanol | LabChem, Inc. (USA) | aja726-5Lpl | |
96-well plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055 | |
Alginate | NovaMatrix | 4200001 | https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/ |
Demineralized or ultrapure (MilliQ) water | |||
Gelatin methacryloyl (GelMA) | Synthetized in-house | detailed protocol (incl materials and references) is available in Loessner et al. (2016), Nature Protocols. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich, Inc. (USA) | 900889 | |
M4 and M5 Allen key | OpenBuilds, inc. (USA) | 179, 190 | also available in every hardware store. https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/ |
OrangeG | Fisher Scientific (USA) | O267-25 | https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725 |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific, Inc. (USA) | 14190-144 | alternativly: PBS tablets: 18912014 (Thermo Fisher Scientific) |
Equipment | |||
Aluminium blocks for temperature dock | Ratek Instruments Pty. Ltd. (Australia) | SB16 | blocks for different tube sizes are available. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html |
Analytical balance | Sartorius AG (Germany) | ED224S | |
Open source liquid handling robot: commercial product | Opentrons Laboratories, Inc. (USA) | OT-One S Pro | https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro |
Open source liquid handling robot: open source hardware | Assembled in-house following an open source approach | hardware and software files are freely accessible on GitHub and Zenodo (links provided); building instructions are provided. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24 | |
Positive displacement pipette: MicromanE | Gilson, Inc. (USA) | FD10006 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html |
Spectrophotometer | BMG LABTECH GmbH (Germany) | CLARIOstar | |
Tips: capillary pistons | Gilson, Inc. (USA) | F148180 | depends on required size. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191 |