Oikopleura dioica är en tunikatmodell organism inom olika biologiområden. Vi beskriver provtagningsmetoder, artidentifiering, odlingsinställningar och odlingsprotokoll för djur och algfoder. Vi lyfter fram nyckelfaktorer som bidragit till att stärka kultursystemet och diskutera eventuella problem och lösningar.
Oikopleura dioica är en plankton ackordat med exceptionell filter-utfodring förmåga, snabb generationstid, bevaras tidig utveckling, och en kompakt arvsmassa. Av dessa skäl anses det vara en användbar modell organism för marina ekologiska studier, evolutionär utvecklingsbiologi och genomik. Eftersom forskning ofta kräver en stadig tillgång på animaliska resurser är det lämpligt att inrätta ett tillförlitligt kultursystem med lågt underhåll. Här beskriver vi en steg-för-steg-metod för att etablera en O. dioica kultur. Vi beskriver hur man väljer potentiella provtagningsplatser, insamlingsmetoder, måldjuridentifiering och upplägget av odlingssystemet. Vi ger felsökningsråd baserat på våra egna erfarenheter. Vi lyfter också fram kritiska faktorer som bidrar till att upprätthålla ett robust kultursystem. Även om kulturprotokollet som finns här är optimerat för O. dioica,hoppas vi att vår provtagningsteknik och kulturinställning kommer att inspirera till nya idéer för att upprätthålla andra ömtåliga pelagiska ryggradslösa djur.
Modellorganismer har varit avgörande för att ta itu med många biologiska frågor, inklusive de som rör utveckling, genetik och fysiologi. Dessutom underlättar ytterligare modellorganismer nya upptäckter och är därför avgörande för att uppnå en större förståelse av naturen1,2. Marina zooplankton är olika grupper av organismer som spelar en viktig roll i havet ekosystem3,,4,,5,6. Trots sin överflöd och ekologiska betydelse, gelatinösa organismer såsom plankton manteldjur är ofta underrepresenterade i plankton biologisk mångfald studier eftersom deras öppenhet och bräcklighet gör fältinsamling och identifiering utmanande7,8. Anpassade provtagningstekniker och laboratorieodling möjliggör närmare observation av djuren in vitro, vilket har främjat kunskapen i biologin hos planktoniska manteldjur9,,10,,11,12.
Larvaceans (Appendicularians) är en klass av fri-simning marina manteldjur bestående av cirka 70 beskrivna arter över hela världen8,13. Eftersom de är en av de vanligaste grupperna inom zooplankton samhällen14,15,16,17, larvaktiga utgör en primär näringskälla för större plankton organismer såsom fisklarver18,19. Till skillnad från ascidians-den sessile mantel-larvaceans behålla en grodyngel-liknande morfologi och förbli planktonic hela livet20. Varje djur bor inuti en egenbyggd, invecklad filtermatningsstruktur som kallas ett hus. De ackumulerar partiklar i sina hus genom att skapa vattenströmmar genom böljande rörelse av deras svansar21. Igensatta hus kasseras hela dagen, varav några bildar kolaggregat och så småningom sjunka till havsbotten22; således larvaceans spelar en viktig roll i den globala kolflödet23. De flesta arter rapporteras leva i pelagiska zonen inom de övre 100 m av vattenpelaren13; Men den gigantiska larvacean Bathochordaeus är känd för att bebo djupet av 300 m24. En studie om Bathochordaeus i Monterey Bay, Kalifornien visade att djuren också fungera som en biologisk vektor av mikroplaster, vilket tyder på en potentiell betydelse för att förstå den roll som bihang i vertikal transport och distribution av mikroplaster i haven25.
Oikopleura dioica, en art av larvacean, har uppmärksammats under de senaste åren som en modell organism på grund av flera anmärkningsvärda egenskaper. Det rapporteras ofta över hela världens hav. Det är särskilt rikligt i kustvatten26, vilket möjliggör enkel provtagning från stranden. Långsiktig, stabil odling är möjlig med både naturligt och konstgjort havsvatten27,,28,29. Temperaturberoende generationstider är så korta som 4-9 dagar i laboratorieförhållanden. Den har hög fruktighet med varje hona som kan producera >300 ägg under hela året. Som en tunicate, upptar det en viktig fylogenetisk position för att förstå chordate evolution30,31. Vid 70 Mb har O. dioica det minsta identifierade genomet bland alla chordates32. Bland larvaceans, O. dioica är den enda beskrivna icke-hermafrodditiska arter hittills33.
Den första framgångsrika O. dioica kultur med laboratorieodlade mikroalger rapporterades av Paffenhöfer34. Det ursprungliga kulturprotokollet med synkronmotorer och paddlar utvecklades av Fenaux och Gorsky35 och antogs senare av flera laboratorier. På senare tid rapporterade Fujii et al.36 O. dioica odling i artificiellt havsvatten, en robust kultur system och fältsamling beskrevs av Bouquet et al.27 och ett optimerat protokoll för en förenklad, prisvärd system rapporterades av Marti-Solans et al.29. Bortsett från den traditionella Oikopleura kultursystem, en nyligen rapporterad design med en dubbel rör uppfödning tank har också potential att kultur Oikopleura sp. 37.Den har inte till någon del av
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för att inleda en O. dioica monokultur baserad på en kombination av protokoll som utvecklats av stora Oikopleura forskargrupper vid Sars International Centre for Marine Molecular Biology27, Universitetet i Barcelona29, Osaka University28, och våra egna observationer. I tidigare publicerade kultur protokoll, detaljerad information om sammansättningen av alg media, land provtagning tekniker och Oikopleura identifiering beskrevs endast grovt, lämnar en hel del tvetydighet. Här, med hjälp av visuell information i videoprotokollet, har vi samlat all viktig information som behövs för att inrätta en O. dioica kultur från grunden på ett enkelt, steg-för-steg sätt. Vi beskriver hur man skiljer O. dioica från en annan vanligen rapporterade arter, O. longicauda, som är en av de mest utmanande stegen. Även om de befintliga kultursystemen är tillämpliga för odling av O. dioica över hela världen, betonar vi vikten av protokolljustering baserad på lokala miljöförhållanden. Den presenterade informationen kombinerar allmänt publicerade data samt kunskap som erhållits genom erfarenhet. Det nuvarande protokollet är idealiskt för forskare som är intresserade av att etablera en kultur från grunden.
För att underlätta flexibiliteten i inrättandet av O. dioica-kulturen är det viktigt att förstå djurens naturliga livsmiljö. Säsongsdata ger information om de fysiska parametrarnas intervall, som kan användas för att styra laboratorieodlingsförhållandena. Det hjälper också att förstå säsongsvariationer i överflödet av djur. I Okinawa, O. dioica är mest tillförlitligt hittas från juni till oktober. Men i Tokyo bay, populationer topp i februari och oktober41. Även om odling av O. dioica rapporteras ofta vid 20 °C eller lägre27,28,29, Okinawan O. dioica visar bättre överlevnad vid temperaturer över 20 °C; Detta kan förklaras av det faktum att den lägsta yttemperaturen havsvatten i Okinawa är ~ 20 ° C(Figur 6). Överflödet av O. dioica kan också påverkas av fytoplankton blommar42 och rovdjur överflöd43,44. Oavsett var O. dioica samlas in, förståelse säsongsvariationer lokalbefolkningen maximerar chansen att provtagning och odling framgång.
Med tanke på lämplig säsong och plats är nettoprovtagning ett effektivt sätt att samla in ett stort antal Oikopleura med minimal ansträngning. Planktonnät med mindre maskstorlek (60-70 μm) får också användas för att samla alla stadier av djuren. Fullt mogna djur finns sällan i nätet, kanske på grund av deras bräcklighet i slutet av livscykeln. Därför uppnås artidentifiering följt av provtagning genom mikroskopisk observation av subchordalceller. Mogna individer uppträder vanligtvis en eller två dagar efter provtagningen när djuren fortsätter att växa i laboratoriet. Även om nettoprovtagningen är effektiv kan alternativa provtagningsmetoder vara nödvändiga under olika omständigheter. Till exempel kan nettoprovtagning nära stadsområden samla in ett stort antal fytoplankton, vilket gör det svårt att isolera Oikopleura. I sådana fall rekommenderas enkel provtagning av skopan för att samla upp provtagning på grundvatten eller båt från områden utanför hamnen. Resultaten visade att den gradvisa förändringen i salthalt på grund av på varandra följande dagar av regn inte påverkade överflödet av O. dioica; Landprovtagning omedelbart efter extrema väderförhållanden, såsom tropiska cykloner, bör dock undvikas. Dessa händelser orsakar plötsliga och drastiska biogeokemiska förändringar i en skyddad vattenförekomst45,46. Dagvatten avrinning kan bära föroreningar, sediment, och överskott näringsämnen, vilket ökar grumlighet och lägre vattenkvalitet47. Filter-utfodring plankton, såsom Oikopleura, kan vara särskilt mottagliga för dessa förändringar på grund av deras sätt att mata och begränsad rörlighet. I sådana fall rekommenderar vi att du skjuter upp provtagningen i några dagar tills de lokala förhållandena återgår till det normala.
Införandet av ett flerstegsfiltersystem är nödvändigt för att upprätthålla små filtermatningsorganismer som O. dioica. Med hjälp av dåligt filtrerat havsvatten (till exempel ett 25 μm maska i det tidigare kultursystemet) var kulturen ofta instabil, särskilt under sommaren, vilket kan bero på det högre överflödet av fytoplankton. Även om vissa fytoplankton är till nytta för O. dioica tillväxt, andra producerar biotoxiner som kan orsaka onormal utveckling av O. dioica embryon48. Dessutom är en hög koncentration av kiselalger som Chaetoceros spp. potentiellt skadliga för O. dioica tillväxt eftersom de kan ha lång setae som kan täppa till huset och förhindra effektiv utfodring49. Vi observerade ofta hus av små djur som är igensatta av C. calcitrans setae; Därför matar vi nu C. calcitrans endast till djur dag 2 och äldre (tabell 3).
Även om det inte var ett problem här, småskaliga långsiktiga odling av O. dioica kan uppleva plötsliga droppar i befolkningsstorlek på grund av en genetisk flaskhals; I sådana fall rekommenderar Martí-Solans et al.29 att lägga till nya vilda individer i kulturen var 20:e generation.
Oikopleura kultursystem är flexibelt. En stabil kultur kan etableras inom en vecka. Långsiktig odling av O. dioica är möjlig på en blygsam budget med icke-specialiserad utrustning. Den dagliga ansträngning som krävs för underhåll av 5-10 bägare av Oikopleura är i allmänhet mindre än 2 timmar med 2 personer. O. dioica kan också bibehållas i konstgjort havsvatten, vilket är fördelaktigt för dem som inte har tillgång till naturligt havsvatten28. Långtidsförvaring av algmat är möjlig med hjälp av fast kultur och kryobevarande29. Dessutom kan O. dioica spermier cryopreserved, och förbli livskraftig i mer än ett år50. Alla dessa faktorer innebär att kulturer lätt kan återupprättas. Slutligen tidigare erfarenheter med oavsiktlig odling av Pleurobrachia sp. kan föreslå att det odlingssystem som utvecklats för Oikopleura potentiellt skulle kunna utvidgas till en bredare gemenskap av ömtåliga pelagiska organismer.
O. dioica fortsätter att ge kraftfulla insikter i olika biologiska fält. En förståelse för lokala säsongsvariationer, ett minutiöst kultursystem och några engagerade individer gör det möjligt att etablera en effektiv kultur med liten ansträngning. Oikopleura kultursystem ger baslinjen resurser för att undersöka ett brett spektrum av biologiska områden som rör ekologi, utveckling, genomik och utvecklingen av denna unika marina chordate.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma mot Garth Ilsley för hans stöd för att etablera kultursystemet. Vi erkänner Ritsuko Suyamas och Sylvain Guillots bidrag till tidig provtagning och artidentifiering. Ett särskilt tack till Hiroki Nishida, Takeshi Onuma och Tatsuya Omotezako för deras generösa stöd och vägledning i hela, inklusive det lokala odlingssystemet och delning av djur och mikroalgalkultur. Vi tackar också Daniel Chourrout, Jean-Marie Bouquet, Anne Aasjord, Cristian Cañestro och Alfonso Ferrández-Roldán för att de delar med sig av sin expertis inom provtagning och odling. Jai Denton, Charles Plessy och Jeffrey Jolly gav ovärderlig feedback på manuskriptet. Charlotte West formulerade en generaliserad ekvation för algberäkning. Slutligen tackar vi OIST för finansiering, Mary Collins och OIST Fieldwork Safety Committee för råd om säkra provtagningsförfaranden, personalen på OIST maskinverkstad för byggandet av odlings- och provtagningsutrustning, och Koichi Toda för leverans av havsvatten.
Activated charcoal | Sigma | C2764-2.5KG | |
Alluminum pulley | Rainbow Products | 10604-10607 | |
Biotin | Sigma | B4501-100MG | |
Boric acid | Wako | 021-02195 | |
Cobalamin (B12) | Sigma | V2876-100MG | |
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Wako | 036-03682 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Wako | 039-04412 | |
Disodium edetate hydrate | Wako | 044-29525 | |
Hexaammonium heptamolybdate tetrahydrate | Wako | 019-03212 | |
Hexagon wrench | Anex | No.6600 | |
Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
Iron(III) chloride hexahydrate | Wako | 091-00872 | |
Jebao programmable auto dosing pump | Jebao | DP-4 | |
Magnet pump | REI-SEA | RMD-201 | |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Wako | 134-15302 | |
Polypropylene wound cartridge filter | Advantec | TCW-10N-PPS | |
TCW-5N-PPS | |||
TCW-1N-PPS | |||
Screwless terminal block | SATO PARTS | SL4500 | |
Simple plankton net | RIGO, Japan | 5512-C | |
Sodium metasilicate | Sigma | 307815-1KG | |
Sodium nitrate | Wako | 195-02545 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | MP Biomedicals | 194740 | |
Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
Synchronous electric motor | Servo | D5N6Z15M | |
Thiamin hydrochloride | Wako | 201-00852 | |
UV sterilizer | Iwaki | UVF-1000 | |
Zinc chloride | MP Biomedicals | 194858 |