रूपात्मक और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए भ्रूण सुपीरियर सर्वाइकल गंगलिया से चूहा सहानुभूति न्यूरॉन्स culturing
Summary
यह पत्र बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया से भ्रूण चूहे सहानुभूति न्यूरॉन्स के अलगाव और खेती का वर्णन करता है। यह इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए न्यूरोनल अर्क तैयार करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान करता है।
Abstract
भ्रूण चूहा बेहतर गर्भाशय ग्रीवा ganglia (एससीजी) से सहानुभूति न्यूरॉन्स अक्षीय विकास, अक्षीय तस्करी, सिनैप्टोजेनेसिस, dendritic विकास, dendritic प्लास्टिसिटी और सह संस्कृति प्रणालियों में तंत्रिका लक्ष्य बातचीत का अध्ययन करने के लिए परिधीय न्यूरॉन्स के लिए एक इन विट्रो मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है । यह प्रोटोकॉल E21 चूहे भ्रूण के बेहतर ग्रीवा गैंगलिया से न्यूरॉन्स के अलगाव और वियोजन का वर्णन करता है, जिसके बाद सीरम-मुक्त माध्यम में शुद्ध न्यूरोनल संस्कृतियों की तैयारी और रखरखाव किया जाता है। चूंकि न्यूरॉन्स अनकोटेड प्लास्टिक का पालन नहीं करते हैं, इसलिए न्यूरॉन्स को या तो 12 मिमी ग्लास कवरलिप या 6-अच्छी प्लेटों पर सुसंस्कृत किया जाएगा जो पॉली-डी-lysine के साथ लेपित हैं। एक एंटीमिटोटिक एजेंट (आरा-सी, साइटोसाइन ए-डी-अरेबिनोफ्यूरिनोसाइड) के साथ उपचार के बाद, यह प्रोटोकॉल 5% से कम गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं के साथ स्वस्थ न्यूरोनल संस्कृतियों को उत्पन्न करता है, जिसे विट्रो में एक महीने से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है। हालांकि भ्रूण चूहा एससीजी न्यूरॉन्स वीवो में 5-8 dendrites के साथ बहुध्रुवीय हैं; सीरम मुक्त परिस्थितियों में, ये न्यूरॉन्स संस्कृति में केवल एक ही अक्षतंख का विस्तार करते हैं और संस्कृति की अवधि के लिए एकध्रुवीय बने रहते हैं। हालांकि, इन न्यूरॉन्स को बेसमेंट झिल्ली निकालने, बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपीएस), या 10% भ्रूण बछड़े सीरम की उपस्थिति में dendrites का विस्तार करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इन समरूप न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला और जैव रासायनिक अध्ययन के लिए किया जा सकता है। यह पेपर इन न्यूरॉन्स में माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन-2 (एमएपी-2) के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिकल धुंधला करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए न्यूरोनल अर्क तैयार करने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल का भी वर्णन करता है।
Introduction
भ्रूणीय बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया (एससीजी) से प्राप्त सहानुभूति न्यूरॉन्स व्यापक रूप से विकास कारक निर्भरता सहित तंत्रिका विकास के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृति प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया गया है, न्यूरॉन-टारगेट इंटरैक्शन, न्यूरोट्रांसमीटर सिग्नलिंग, एक्सोनल ग्रोथ, डेंड्राइट डेवलपमेंट एंड प्लास्टिसिटी, सिनैप्टोजेनेसिस और सिग्नलिंग मैकेनिज्म अंतर्निहित तंत्रिका-लक्ष्य/न्यूरॉन-ग्लिया इंटरैक्शन1,,2,,3,,4,,5,,6,7,,8,,9., उनके छोटे आकार (लगभग 10000 न्यूरॉन्स/गैंगलिया) के बावजूद, इस संस्कृति प्रणाली के विकास और व्यापक उपयोग के तीन मुख्य कारण हैं) सहानुभूति श्रृंखला में पहला गैंगलिया होने के नाते, वे बड़े हैं, और इसलिए बाकी सहानुभूति गैंगलिया10की तुलना में अलग करना आसान है; ii) केंद्रीय न्यूरॉन्स के विपरीत, एससीजी में न्यूरॉन्स तंत्रिका शिखा से प्राप्त होने वाले सभी न्यूरॉन्स के साथ काफी सजातीय हैं, एक समान आकार वाले, तंत्रिका विकास कारक पर निर्भरता और न ही-एड्रेनेर्जिक। यह उन्हें रूपात्मक और जीनोमिक अध्ययन10, 11,11 और iii के लिए एक मूल्यवान मॉडल बनाता है) इन न्यूरॉन्स को एक परिभाषित सीरम-मुक्त माध्यम में बनाए रखा जा सकता है जिसमें तंत्रिका विकास कारक एक महीने से अधिक10,,12के लिए है। डेन्ड्राइट्स2की दीक्षा और रखरखाव में अंतर्निहित तंत्रों का अध्ययन करने के लिए प्रसवकालीन एससीजी न्यूरॉन्स का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। इसका मुख्य कारण यह है कि, हालांकि एससीजी न्यूरॉन्स में वीवो में एक व्यापक डेंड्रिटिक आर्बर होता है, वे सीरम की अनुपस्थिति में विट्रो में dendrites का विस्तार नहीं करते हैं, लेकिन हड्डी मॉर्फोजेटिक,प्रोटीन2, 12,,13जैसे कुछ विकास कारकों की उपस्थिति में dendrites विकसित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है।13
यह कागज भ्रूण चूहे एससीजी न्यूरॉन्स को अलग करने और बनाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। पिछले 50 वर्षों में, एससीजी से प्राथमिक न्यूरोनल संस्कृतियों का उपयोग मुख्य रूप से बड़े पैमाने पर जीनोमिक या प्रोटेओमिक परिवर्तनों की जांच करने वाले सीमित संख्या में अध्ययनों के साथ रूपात्मक अध्ययनों के लिए किया गया है। यह मुख्य रूप से छोटे ऊतक आकार के कारण होता है जिसके परिणामस्वरूप डीएनए या प्रोटीन की कम मात्रा में अलगाव होता है, जिससे इन न्यूरॉन्स पर जीनोमिक और प्रोटेओमिक विश्लेषण करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, हाल के वर्षों में, बढ़ी हुई पहचान संवेदनशीलता ने डेंड्रिटिक,विकास विकास14, 15, 16, 17के दौरान एससीजी न्यूरॉन्स मेंजीनोम,15,16मिरनोम और प्रोटेम की जांच करने के तरीकों के विकास को सक्षम बनाया है।17 यह पेपर इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का उपयोग करके इन न्यूरॉन्स के रूपात्मक विश्लेषण के लिए विधि और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्रिक विश्लेषण के लिए न्यूरोनल प्रोटीन अर्क प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल का भी वर्णन करेगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह कागज भ्रूण चूहे पिल्ले के बेहतर गर्भाशय ग्रीवा गैंगलिया से सहानुभूति न्यूरॉन्स को बनाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस मॉडल प्रणाली का उपयोग करने के फायदे यह हैं कि विकास कारकों के लिए एक सम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को सेंट मैरी कॉलेज ऑफ कैलिफोर्निया में फैकल्टी डेवलपमेंट फंड एंड समर रिसर्च प्रोग्राम ग्रांट द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक ों को भी डेविस में कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में डॉ पामेला Lein और यूसी बर्कले मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा में डॉ एंथनी Iavarone इन प्रोटोकॉल के विकास के दौरान उनकी सलाह के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । लेखक वीडियो उत्पादन और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए कैलिफोर्निया के सेंट मैरी कॉलेज में कॉलेज कम्युनिकेशंस के कार्यालय में हेली नेल्सन का भी शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| 2D nanoACQUITY | Waters Corporation | ||
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| BMP-7 | R&D Systems | 354-BP | |
| Bovine Serum Alumin | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| Cell scraper | Corning | CLS-3010 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | 4176 | |
| Corning Costar or Nunc Flat bottomed Cell culture plates | Fisher Scientific | 07-200, 140675, 142475 | |
| Cytosine- β- D-arabinofuranoside | Sigma-Aldrich | C1768 | |
| D-phosphate buffered saline (Calcium and magnesium free) | ATCC | 30-2200 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 15230 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| DMEM – Low glucose + Glutamine, + sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11885 | |
| Fatty Acid Free BSA | Calbiochem | 126609 | 20 mg/mL stock in low glucose DMEM |
| Fine forceps Dumont no.4 and no.5 | Ted Pella Inc | 5621, 5622 | |
| Forceps and Scissors for Dissection | Ted Pella Inc | 1328, 1329, 5002 | |
| Glass coverlips – 12mm | Neuvitro Corporation | GG-12 | |
| Goat-Anti Mouse IgG Alexa 488 conjugated | Thermo Fisher Scientific | A32723 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765 | |
| Hank's balanced salt soltion (Calcium and Magnesium free) | Thermo Fisher Scientific | 14185 | |
| Insulin-Selenium-Transferrin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 41400-045 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | A3221 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
| Leibovitz L-15 medium | Thermo Fisher Scientific | 11415064 | |
| Mounting media for glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | P36931, P36934 | |
| Mouse-anti- MAP2 antibody (SMI-52) | BioLegend | SMI 52 | |
| Nerve growth factor | Envigo Bioproducts (formerly Harlan Bioproducts) | BT5017 | Stock 125 μg/mL in 0.2% Prionex in DMEM |
| Paraformaldehye | Spectrum Chemicals | P1010 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Prionex | Millipore | 529600 | 10% solution, 100 mL |
| RapiGest SF | Waters Corporation | 186001861 | 5 X 1 mg |
| Synapt G2 High Definition Mass Spectrometry | Waters Corporation | ||
| Trifluoro acetic acid – Sequencing grade | Thermo Fisher Scientific | 28904 | 10 X 1 mL |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin | Promega or NEB | V511A, P8101S | 100 μg or 5 X 20 mg |
| Waters Total recovery vials | Waters Corporation | 186000385c |
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