Ensaios para validação de inibidores de acetiltransferase histone

Summary

Inibidores de acetiltransferases de histona (HATs, também conhecidos como acetiltransferases de lisina), como CBP/p300, são potenciais terapêuticos para o tratamento do câncer. No entanto, são necessários métodos rigorosos para validar esses inibidores. Três métodos in vitro para validação incluem ensaios HAT com acetiltransferases recombinantes, imunoblotting para acetilação de histona na cultura celular, e ChIP-qPCR.

Abstract

Acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam acetilação de resíduos de lisesina em histones e outras proteínas para regular a dinâmica da cromatina e a expressão genética. Os TRTs, como o CBP/p300, estão sob intensa investigação como alvos terapêuticos devido ao seu papel crítico na tumorgênese de diversos cânceres. O desenvolvimento de novos inibidores de moléculas pequenas visando a função histone acetyltransferase (HAT) dos KATs é desafiador e requer ensaios robustos que podem validar a especificidade e potência dos inibidores potenciais.

Este artigo descreve um pipeline de três métodos que fornecem rigorosa validação in vitro para novos inibidores de HAT (HATi). Estes métodos incluem um ensaio hat do tubo de ensaio, ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI) e PCR quantitativo de imunoprecipitação de Chromatina (ChIP-qPCR). No ensaio hat, hats recombinantes são incubados com histones em uma reação de tubo de ensaio, permitindo acetilação de resíduos específicos de lisesina nas caudas de histona. Esta reação pode ser bloqueada por um HATi e os níveis relativos de acetilação de histona específica do local podem ser medidos através de imunoblotação. Os inibidores identificados no ensaio hat precisam ser confirmados no ambiente celular.

O ensaio chhai usa imunoblotting para tela para o novo HATi que atenua a robusta hiperacetilação de histones induzidos por um inibidor de histon deacetilase (HDACi). A adição de um HDACi é útil porque os níveis basais de acetilação de histona podem ser difíceis de detectar através da imunoblotação.

Os ensaios HAT e ChHAI medem as mudanças globais na acetilação de histona, mas não fornecem informações sobre acetilação em regiões genômicas específicas. Portanto, o ChIP-qPCR é usado para investigar os efeitos do HATi nos níveis de acetilação de histona em elementos regulatórios genéticos. Isso é realizado através da imunoprecipitação seletiva de complexos histono-DNA e análise do DNA purificado através de qPCR. Juntos, esses três ensaios permitem a validação cuidadosa da especificidade, potência e mecanismo de ação da nova HATi.

Introduction

As acetiltransferases de lysina (KATs) catalisam a acetilação de resíduos de lisesina nas proteínas histona e não histona^1,,2,,3,,4. Pesquisas recentes revelam que os KATs e sua função acetiltransferase podem promover o crescimento sólido do tumor^4,5,6,7,8,9. Por exemplo, a proteína de ligação CREB (CBP)/p300 são dois KATs paralogos que regulam inúmeras vias de sinalização no câncer^2,,3. CBP/p300 tem uma função de acetiltransferase de histona bem caracterizada (HAT) e catalisa histone 3 Lysine 27 acetilação (H3K27ac)^{2,,4,,5,10,,11}, um marcador importante para melhoradores ativos, regiões promotoras e transcrição genética ativa^12,,13,,14. CBP/p300 servem como co-ativadores críticos para vias de sinalização pró-crescimento em tumores sólidos, ativando a transcrição de oncogenes através da acetilação de histones e outros fatores de transcrição^{4,,9,,15,,16,,17,18}. Devido ao seu papel na progressão do tumor, CBP/p300 e outros KATs estão sob investigação para o desenvolvimento de novos inibidores que bloqueiam sua função oncogênica^{4,,5,6,,7,,8,,9,,18,,19,20}. A-485 e GNE-049 representam duas tentativas bem sucedidas de desenvolver inibidores potentes e específicos para CBP/p300^4,9. Inibidores adicionais estão atualmente sob investigação para CBP/p300 e outros KATs.

A qualidade dos inibidores kat previamente descritos (KATi) está sendo questionada, com muitos inibidores mostrando efeitos-alvo e má caracterização²¹. Portanto, a caracterização rigorosa e validação de novos candidatos a medicamentos é essencial para o desenvolvimento de sondas químicas de alta qualidade. Delineados aqui estão três protocolos que formam um pipeline para triagem e validando rigorosamente a potência e especificidade do novo KATi, com foco específico em inibir a função HAT (HATi) de KATs. CBP/p300 e seus inibidores são usados como exemplos, mas esses protocolos podem ser adaptados para outros KATs que possuem uma função HAT⁷.

O primeiro protocolo é um ensaio in vitro de acetiltransferase de histona (HAT) que utiliza p300 recombinantes purificados e histones em uma reação controlada do tubo de ensaio. Este ensaio é simples de executar, é econômico, pode ser usado para tela compostos em uma configuração de baixo rendimento, e não requer materiais radioativos. Neste protocolo, p300 recombinante catalisa acetilação de lise em caudas de histona durante um breve período de incubação e os níveis de acetilação de histona são medidos usando procedimentos padrão de imunoblotação. A reação enzimática pode ser realizada na presença ou ausência de inibidores CBP/p300 para testar compostos que reduzem a acetilação de histona. Além disso, o ensaio HAT pode ser usado para verificar se novos compostos são seletivos para CBP/p300, avaliando sua atividade contra outros KATs purificados, como o PCAF. O ensaio hat é um excelente ponto de partida para investigar novos inibidores devido à sua simplicidade, baixo custo e capacidade de determinar a potência/seletividade de um inibidor. De fato, este protocolo é frequentemente usado na literatura como uma tela in vitro^5,10. No entanto, os inibidores identificados no ensaio hat nem sempre são eficazes na cultura celular porque uma reação do tubo de ensaio é muito mais simples do que um sistema celular vivo. Portanto, é essencial caracterizar ainda mais os inibidores nos experimentos de cultura celular^22,23.

O segundo protocolo no pipeline é o ensaio de inibição de hiperacetilação de Chromatina (ChHAI). Este ensaio baseado em célula utiliza inibidores de histona deacetilase (HDACi) como uma ferramenta para hiperacetilar histones em cromatina antes da co-incubação com um HATi²⁴. A acetilação de histona basal pode ser baixa na cultura celular, dificultando a sondagem para via imunoblotação sem a adição de um HDACi para aumentar a acetilação. O objetivo do ensaio chhai é identificar o novo HATi que pode atenuar o aumento da acetilação de histona causada pela inibição do HDAC. As vantagens deste ensaio incluem seu baixo custo, relativa facilidade de execução, e o uso de células na cultura, o que proporciona mais relevância fisiológica do que o ensaio hat do tubo de ensaio. Semelhante ao ensaio hat, este protocolo usa imunoblotting padrão para coleta de dados.

Os ensaios HAT e ChHAI fornecem dados sobre a potência de novos compostos para inibir a acetilação global de histona, mas não fornecem informações sobre como esses compostos afetam modificações em regiões genômicas específicas. Portanto, o protocolo final, Chromatin Immunoprecipitation-quantitative Polymerase Chain Reaction (ChIP-qPCR) é um experimento de cultura celular que investiga interações DNA-proteína em regiões específicas do genoma. No protocolo ChIP, a cromatina é interligada para preservar as interações DNA-proteína. A cromatina é então extraída das células e o complexo DNA-proteína sofre imunoprecipitação seletiva para a proteína de interesse (por exemplo, usando um anticorpo específico para H3K27ac). O DNA é então purificado e analisado usando qPCR. Por exemplo, o ChIP-qPCR pode ser usado para determinar se um novo HATi diminui a acetilação de histona em oncogenes individuais, como Cyclin D1²⁵. Embora o ChIP-qPCR seja uma técnica comum usada no campo, pode ser difícil otimizar^4,,10,26. Este protocolo fornece dicas para evitar possíveis armadilhas que podem ocorrer durante a realização do procedimento ChIP-qPCR e inclui verificações de controle de qualidade que devem ser realizadas nos dados.

Quando utilizados em conjunto, esses três protocolos permitem a caracterização rigorosa e validação do novo HATi. Além disso, esses métodos oferecem muitas vantagens porque são fáceis de executar, relativamente baratos e fornecem dados sobre acetilação de histona global e regional.

Protocol

1. Ensaio in vitro HAT Preparação de bufferNOTA: Consulte a Tabela 1 para obter receitas de tampão. Prepare 5x tampão de ensaio e 6x Sulfato de Dodecyl de Sódio (SDS) e armazene a -20 °C. Aliquot SDS em alíquotas de 1 mL. Prepare o tampão de corrida de gel SDS 10x e 10x TBST e armazene à temperatura ambiente. Prepare 1x tampão de transferência e armazene a 4 °C.ATENÇÃO: Verifique a ficha técnica de segurança de todos os pro…

Representative Results

O ensaio in vitro histone acetyltransferase (HAT) pode ser usado para sondar compostos que inibem a atividade p300 HAT em direção a um substrato de histona. A Figura 1A fornece um esquema experimental para o ensaio hat. O ácido anacácárico, um conhecido HATi3,38, foi utilizado neste ensaio em uma faixa de concentração de 12,5-100 μM. A 100 μM, o ácido anacárico diminui a p300 catalisada acetilação histona em Histone 3, L…

Discussion

Acetiltransferases de lysina (KATs) acetilamam vários resíduos de lisesina nas caudas de histona e fatores de transcrição para regular a transcrição genética^2,3. O trabalho nas últimas duas décadas revelou que os KATs, como CBP/p300, PCAF e GCN5, interagem com fatores de transcrição oncogênica e ajudam a impulsionar o crescimento do tumor em vários tipos de tumores sólidos^4,5,,<su…

Materials

1.5 ml tube	Fisher Scientific	05-408-129	For all methods
10 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3902	For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tips	Fisher Scientific	02-707-454	For all Methods
1000 ul tips	Corning	4846	For all Methods
10X Glycine buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running Buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBST			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plate	Corning	3513	For Method 2
15 cm dish	Sarstedt AG & Co.	83.3903	For Method 3
15 ml conical tube	Santa Cruz Biotechnology	sc-200249	For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium Azide			For Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milk			For Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tips	Corning	4844	For all Methods
2-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gel	Thermo Fisher: Invitrogen	XP04205BOX	For Methods 1 and 2
5X Assay buffer			For Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis buffer			For Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485	MedChemExpress	HY-107455	CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibody	Cell Signaling Technology	4771	For Method 1
Acetyl-CoA	Sigma-Aldrich	A2056	for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)	Cell Signaling Technology	CST 8173	antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)	Cell Signaling Technology	CST 9675	antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibody	Millipore Sigma	T5168	For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acid	Cayman Chemical	13144	For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibody	Cell Signaling Technology	7076	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibody	Jackson ImmunoResearch	711-035-152	For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography film	MIDSCI	BX810	For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating Platform	Stovall Life Science Incorporated	not available	For Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)	HyClone	SH30072.03	cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	for buffer preparation
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	for SDS sample buffer preparation
CDTA	Spectrum Chemical	125572-95-4	For buffer preparation
cell scraper	Millipore Sigma	CLS3010	For Method 3
ChIP dilution buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution Buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 Cells			For Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBE	Covaris	520045	Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicator	Covaris	S220	DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	41639	for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815	for SDS sample buffer preparation
DMEM	Corning	10-013-CV	cell culture media
EDTA	Fisher Scientific	BP120-1	for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatus	Bio-rad	1704070	For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	Millipore Sigma	17-10086	For Method 3
FK228 (Romidepsin)	Cayman Chemical	128517-07-7	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F8775	for cell fixation
glycerol	Fisher Scientific	BP229-1	For buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	G7126	for buffer preparation
HEPES	Sigma-Aldrich	54457	for buffer preparation
High salt wash buffer			For Method 3
IGEPAL (NP-40)	Sigma-Aldrich	I3021	for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP Substrate	Millipore Sigma	WBKLS0500	For Methods 1 and 2
KCl	Fisher Scientific	BP366-500	for buffer preparation
LiCl	Sigma-Aldrich	L9650	For buffer preparation
LiCl wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic Separator	Promega	Z5341	For use in Method 3
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	For buffer preparation
Mini gel tank	Invitrogen	A25977	For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)	Cayman Chemical	209783-80-2	HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	for buffer preparation
NaOH	Fisher Scientific	S318-100	for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgG	Bethyl Laboratories	P120-101	Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup Kit	Qiagen	28104	For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100X	Corning	30-002-CI	cell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV	For Methods 2 and 3
PIPES	Sigma-Aldrich	80635	for buffer preparation
powdered milk	Nestle Carnation		For Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transfer	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel running	Bio-rad		For Methods 1 and 2
Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher	26616	For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	PI8340	for use in Method 3
Protein A Magentic Beads	New England BioLabs	S1425S	For use in Method 3
Proteinase K	New England BioLabs	P8107S	For use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal Controller	MJ Research Inc.	PTC-100	For Method 1
PVDF Transfer Membrane	Millipore Sigma	IEVH00005	For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1	New England BioLabs	M2503S	for use in Method 1
Recombinant p300	ENZO Life Sciences	BML-SE451-0100	for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium Azide	Fisher Scientific	26628-22-8	For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500	for buffer preparation
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71725	for SDS sample buffer preparation
Standard Heatblock	VWR Scientific Products	MPN: 949030	For Methods 1 and 2
Table top centrifuge	Eppendorf	5417R	For all methods
TE buffer			For Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer buffer			For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin A	Cayman Chemical	58880-19-6	HDAC Inhibitor for use in Method 2
Tris	Fisher Scientific	BP152-5	for buffer preparation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	for buffer preparation
Tween 20	Sigma-Aldrich	9005-64-5	for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processor	Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.	SRX-101A	For Methods 1 and 2