En automatiseret differentiale nuklear farvning assay til nøjagtig bestemmelse af Mitocan Cytotoxicity
Summary
Protokollen beskriver en hurtig, høj-gennemløb, pålidelig, billig, og upartisk analyse for effektivt at bestemme cellulære levedygtighed. Denne analyse er især nyttig, når cellernes mitokondrier er blevet beskadiget, hvilket forstyrrer andre analyser. Analysen bruger automatiseret optælling af celler farves med to nukleare farvestoffer – Hoechst 33342 og propidium iodid.
Abstract
Mitokondriens bidrag til onkogene omdannelse er genstand for stor interesse og aktiv undersøgelse. Som inden for kræft metabolisme bliver mere kompleks, målet om at målrette mitokondrier ved hjælp af forskellige forbindelser, der påfører mitokondriel skade (såkaldte mitocans) er ved at blive meget populære. Desværre, mange eksisterende cytotoksicitet assays, såsom dem baseret på tetrazolium salte eller resazurin kræver funktionelle mitokondrielle enzymer for deres ydeevne. Den skade, der påføres af forbindelser, der er målrettet mitokondrier ofte kompromitterer nøjagtigheden af disse analyser. Her beskriver vi en modificeret protokol baseret på differentialfarvning med to fluorescerende farvestoffer, hvoraf den ene er celle-permeant (Hoechst 33342) og den anden er ikke (propidium iodid). Forskellen i farvning gør det muligt at diskriminere levende og døde celler. Analysen er modtagelig for automatiseret mikroskopi og billedanalyse, hvilket øger gennemløb og reducerer bias. Dette gør det også muligt analysen, der skal anvendes i høj-throughput mode ved hjælp af 96-brønd plader, hvilket gør det til en farbar vej for drug opdagelse indsats, især når de pågældende lægemidler har en vis grad af mitotoksicitet. Det er vigtigt, at resultater opnået ved Hoechst/PI-farvningsanalyse viser øget konsistens, både med trypanblå eksklusionsresultater og mellem biologiske replikater, når analysen sammenlignes med andre metoder.
Introduction
Det første skridt til at identificere effektive kræftbehandlinger er udvælgelsen af en robust, upartisk cytotoksicitet assay, der kan bruges til at undersøge effekten af behandlingen. Et fælles valg for lav-throughput eksperimenter er udelukkelsen af trypan blå farvestof fra levende celler. Denne metode er begunstiget, fordi det giver en relativt upartisk metode til kvantificering celle overlevelse. trypan blå passivt diffunderer i celler, hvis membraner er kompromitteret, men det er effektivt blokeret fra at komme ind i raske celler1. Kvotienten af de levende celler og de samlede celler repræsenterer den procentvise levedygtighed, hvilket indikerer effekten af behandlingen. Den væsentligste ulempe ved trypan blå analyse er, at det er dårligt egnet til høj-throughput metoder. Det har et relativt lavt signal-støj-forhold og langvarig farvning kan resultere i artefakter på grund af farvning af levedygtige celler. Derfor er trypan blå udelukkelse typisk, men ikke altid2, henvist til manuel optælling. Dette gør det for langsomt og introducerer den stærke mulighed for partiskhed på grund af subjektive dom af forskeren (medmindre blændende eller uafhængige tæller anvendes, hvilket yderligere reducere laboratorie gennemløb). Generelt, gennemløb af denne analyse er utilstrækkelig til moderne stof opdagelse.
Rentabilitetsanalyser, som generelt har en langt højere gennemløb, giver forskerne mulighed for at omgå denne begrænsning, men kommer med betydelige forbehold (se tabel 1). Disse metoder falder generelt i to grupper. En gruppe består af kolojære analyser, der er baseret på funktionen af cellulære redox enzymer. Farveløse eller ikke-fluorescerende substrater omdannes til levende produkter, der kan kvantificeres ved hjælp af et spektrofotometer. Klassiske eksempler omfatter tetrazolium salte (MTT, WST-1, XTT, osv.) og resazurin. Denne kategori omfatter også selvlysende analyser, der udnytter luciferin at evaluere ATP niveau. Analyser af denne type har den underliggende begrænsning, at de måler cellulære stofskifte, som ikke er cellulære levedygtighed i sig selv. Det er ret almindeligt, at celler bliver quiescent under ugunstige forhold, men stadig bevare evnen til atopdele 3,4,5. For eksempel, kræft stamceller er ofte relativt metabolisk quiescent6,7,8,9, og vil sandsynligvis være vanskeligt at analysere ved hjælp af disse teknikker. Effektiviteten af behandlinger, der skader mitokondriel funktion, såsom de fleste mitocans, er også sandsynligt, at være betydeligt overvurderet.
En alternativ metode udnytter de kemiske egenskaber af forskellige stoffer, der giver dem mulighed for enten at krydse eller ikke krydse biologiske membraner. Et eksempel er nukleare pletter såsom SYTOX eller propidium iodid (PI). Denne kategori omfatter også analyser, der ligner hinanden i konceptet, men forskellige i funktion, såsom laktatdehydrogenase (LDH)-analysen, som måler frigivelsen af LDH i det ekstracellulære miljø som indikator for cellulær nekrose (Figur 1, Tabel 1). Disse analyser er mere i stand til at skelne mellem metabolisk inaktive og døde celler.
| Analyse/farvestof | Type(er) af celledød opdaget | Nødvendigt udstyr | Vigtige funktioner |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (resazurin) | Apoptose/Nekrose | Spektrofotometer | Billig, hurtig; endepunktsanalyse afhænger af enzymers aktivitet (udelukkende mitokondriel i tilfælde af MTT) og diskriminerer ikke mellem celledødstyper1,10 |
| LDH-udgivelse | Nekrose | Spektrofotometer | Hurtig, uafhængig af mitokondrielle enzymers aktivitet; dyrt for test med høj gennemløb; detekektære celler med compromiseretplasmamembran 11,12 |
| Trypan Blå (TB) | Apoptose/Nekrose | Mikroskop | Celle-impermeant; ikke diskriminerer mellem celledødsformer arbejdsformig og ikke egnet til screening med høj gennemløb vanskeligere at bruge med klæbende celler; tilbøjelige til subjektiv dømmekraft fra brugerens måde, men betragtes som standardmetode til måling af cellernes levedygtighed13 |
| Acridine orange (AO) | Apoptose/Nekrose/ | Fluorescensmikroskop | Et nukleinsyrefarvestof med unikke spektrale egenskaber kan skelne mellem apoptose og nekrose/nekroptose14 |
| Nekrokose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Fluorescensmikroskop eller flowcytometer | Cellepermeerbar; upassende i sig selv til at overvåge celledød; nyttige til co-farvning; kan anvendes til at vurdere kromatinkondensation og kernefragmentering i tidlig apoptose; kan parres med propidiumidodid for at skelne apoptose fra nekrose15,16 |
| Propidiumidodid (PI) | Sen apoptose/Nekrose | Fluorescensmikroskop eller flowcytometer | Celle-impermeant intercalator; registrerer både sen apoptose og nekrosetilstande for celledød17. Giftig og gennemtrængelig efter lange inkubationstider18 |
Tabel 1. Liste over cytotoksicitetsanalyser. Cytotoksicitetsanalyser, hvoraf nogle blev brugt i denne undersøgelse, opført sammen med den korte beskrivelse af deres vigtigste funktioner.
Nylige undersøgelser har vist, at mitokondriel metabolisme er ændret i nogle kræftformer19,20,21,22,23,24,25. For eksempel har akut myeloid leukæmi (AML) vist sig at upregulate deres mitokondrielle masse, mtDNA indhold, og mitokondrielle åndedræt for at opfylde deres energibehov19,26,27. På den anden side, nogle solide tumorer er karakteriseret ved mitokondriel dysfunktion, eller rettere “metabolisk omprogrammering”, såsom downregulation af mitokondrielle proteiner involveret i OXPHOS eller nedsat mtDNA indhold, der har været forbundet med tumor invasiv, metastatisk potentiale og resistens over for apoptose-inducerende lægemidler28,29. Desuden, for nylig, der har været en øget interesse i at bruge mekanistisk forskellige forbindelser, der påvirker mitokondrielle funktion (generelt kaldet mitocans30), som potentielle behandlinger for særlige kræftformer. Disse lægemidler er rettet mod ATP syntese, mitokondrielle DNA, OXPHOS, og ROS produktion, samt pro-apoptotiske og anti-apoptotiske proteiner forbundet med mitokondrier30,31. Flere undersøgelser har vist , at denne fremgangsmåde har et betydeligt løfte19,32,33,34. Men, disse metaboliske afvigelser i kræft cellebiologi eller mitokondrier-målretning behandlinger kan i væsentlig grad påvirke konventionelle levedygtighed assays, der er baseret på mitokondriel funktionalitet.
Her er en optimeret protokol for en differentieret nuklear farvning assay beskrevet. Protokollen giver mulighed for hurtig og præcis bestemmelse af cytotoksicitet af mitocans eller deres kombinationer med andre forbindelser. Hoechst 33342 er et cellepermeant nukleart farvestof, der let krydser cellemembraner for at plette DNA, så det samlede celletal kan opnås. Ved co-farvning med PI, som kun kommer ind i kerner af døde celler, kan andelen af levende (Hoechst kun) og døde (farves med begge) celler præcist bestemmes. Denne protokol forædler den offentliggjorte analyse35 ved at tilføje et trin til optimering af farvestofkoncentrationen (ved krydsrefererende resultater med ortogonal trypan blå metode) og centrifugering af pladen før billeddannelse. Da mange cellelinjer er semi-klæbende eller suspenderet, centrifugering øger andelen af celler, der er afbildet og stærkt forbedrer nøjagtigheden. Analysen har flere fordele, herunder at farvning ikke kræver fjernelse af medier eller vask. Farvestoffet blandingen er også billig, let at forberede, og kompatibel med multichannel / robot pipetting systemer.
Efter celler er blevet plettet, er de afbildet med et automatiseret mikroskop. Dette har den ekstra fordel at skabe en permanent registrering af de billeder, der kan re-analyseres senere, og virkningerne af bestemte forbindelser kan revurderes ved visuel inspektion af optagne billeder. Når billederne er opnået, kan celler tælles enten manuelt eller ved hjælp af flere softwarepakker, herunder både gratis (f.eks. ImageJ, CellProfiler osv.) og kommerciel software (f.eks. Automatiseret celletælling er generelt at foretrække, da korrekt udviklede automatiserede celletællingspipelines er mere nøjagtige og mindre forudindtagede end manuelle optællinger. De har også mere effektivt se bort fra cellerester eller uopløselige komplekser. Udviklingen af disse rørledninger er generelt ligetil og forenkles af effektiviteten af de anvendte pletter. Outputtet er kvantitativt, da det faktiske antal døde celler automatisk beregnes i forhold til det samlede celletal, og der kan anvendes forskellige tærskler for at øge eller mindske strengheden af detektion35. For nemheds skyld er optimerede parametre til optælling af celler ved hjælp af Gen5 v. 3.00-softwarekompatibel Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader inkluderet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om protokollen for Hoechst/PI cytotoksicitetsanalyse er robust og kræver forholdsvis lidt praktisk tid, er der flere eksperimentelle detaljer, der er meget vigtige for at sikre nøjagtige resultater. For det første er det vigtigt at sikre, at koncentrationen af DMSO forbliver under 0,5 % (v/v). Der er almindelig enighed om , at eksponering for selv lave doser af DMSO i væsentlig grad kan ændre morfologien og fastgørelsen af celler og i væsentlig grad forsinke cellecyklusprogressionen39<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, en CPRIT forsker i Cancer Research, takker Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) for deres generøse støtte, CPRIT tilskud RR150044. Dette arbejde blev også støttet af Welch Foundation Research Grant C-1930, og af National Institutes of Health R35 GM129294 tildelt NVK. Finansieringskilderne havde ingen rolle i studiet design, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller udarbejdelse af manuskriptet.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
References
- Ramirez, C. N., Antczak, C., Djaballah, H. Cell viability assessment: toward content-rich platforms. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (3), 223-233 (2010).
- Melzer, S., et al. Trypan blue as an affordable marker for automated live-dead cell analysis in image cytometry. Scanning. 38 (6), 857-863 (2016).
- Sikora, E., Mosieniak, G., Sliwinska, M. A. Morphological and Functional Characteristic of Senescent Cancer Cells. Current Cancer Drug Targets. 17 (4), 377-387 (2016).
- Coppé, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Castro-Vega, L. J., et al. The senescent microenvironment promotes the emergence of heterogeneous cancer stem-like cells. Carcinogenesis. 36 (10), 1180-1192 (2015).
- Weihua, Z., Lin, Q., Ramoth, A. J., Fan, D., Fidler, I. J. Formation of solid tumors by a single multinucleated cancer cell. Cancer. 117 (17), 4092-4099 (2011).
- Osisami, M., Keller, E. T. Mechanisms of Metastatic Tumor Dormancy. Clinical Medicine. 2 (3), 136-150 (2013).
- Zhang, S., et al. Generation of cancer stem-like cells through the formation of polyploid giant cancer cells. Oncogene. 33 (1), 116-128 (2014).
- Mittal, K., et al. Multinucleated polyploidy drives resistance to Docetaxel chemotherapy in prostate cancer. British Journal of Cancer. 116 (9), 1186-1194 (2017).
- McKeague, A. L., Wilson, D. J., Nelson, J. Staurosporine-induced apoptosis and hydrogen peroxide-induced necrosis in two human breast cell lines. British Journal of Cancer. 88 (1), 125-131 (2003).
- Kaja, S., et al. An optimized lactate dehydrogenase release assay for screening of drug candidates in neuroscience. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 73, 1-6 (2015).
- Chan, F. K., Moriwaki, K., De Rosa, M. J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Methods in Molecular Biology. 979, 65-70 (2013).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell Counting and Viability Assessment of 2D and 3D Cell Cultures: Expected Reliability of the Trypan Blue Assay. Biological Procedures Online. 19, 8 (2017).
- Plemel, J. R., et al. Unique spectral signatures of the nucleic acid dye acridine orange can distinguish cell death by apoptosis and necroptosis. Journal of Cell Biology. 216 (4), 1163-1181 (2017).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death & Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
- Brauchle, E., Thude, S., Brucker, S. Y., Schenke-Layland, K. Cell death stages in single apoptotic and necrotic cells monitored by Raman microspectroscopy. Scientific Reports. 4, 4698 (2014).
- Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 219-228 (2014).
- Panina, S. B., Baran, N., Brasil da Costa, F. H., Konopleva, M., Kirienko, N. V. A mechanism for increased sensitivity of acute myeloid leukemia to mitotoxic drugs. Cell Death & Disease. 10 (8), 617 (2019).
- Caro, P., et al. Metabolic signatures uncover distinct targets in molecular subsets of diffuse large B cell lymphoma. Cancer Cell. 22 (4), 547-560 (2012).
- Lagadinou, E. D., et al. BCL-2 inhibition targets oxidative phosphorylation and selectively eradicates quiescent human leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 12 (3), 329-341 (2013).
- Senft, D., Ronai, Z. A. Regulators of mitochondrial dynamics in cancer. Current Opinion in Cell Biology. 39, 43-52 (2016).
- Vazquez, F., et al. PGC1α expression defines a subset of human melanoma tumors with increased mitochondrial capacity and resistance to oxidative stress. Cancer Cell. 23 (3), 287-301 (2013).
- Caino, M. C., Altieri, D. C. Cancer cells exploit adaptive mitochondrial dynamics to increase tumor cell invasion. Cell Cycle. 14 (20), 3242-3247 (2015).
- Ralph, S. J., Rodríguez-Enríquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., Moreno-Sánchez, R. The causes of cancer revisited: “mitochondrial malignancy” and ROS-induced oncogenic transformation – why mitochondria are targets for cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 31 (2), 145-170 (2010).
- Kreitz, J., et al. Metabolic Plasticity of Acute Myeloid Leukemia. Cells. 8 (8), (2019).
- Sriskanthadevan, S., et al. AML cells have low spare reserve capacity in their respiratory chain that renders them susceptible to oxidative metabolic stress. Blood. 125 (13), 2120-2130 (2015).
- Guerra, F., et al. Mitochondrial Dysfunction: A Novel Potential Driver of Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Cancer. Frontiers in Oncology. 7, 295 (2017).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Neuzil, J., Dong, L. F., Rohlena, J., Truksa, J., Ralph, S. J. Classification of mitocans, anti-cancer drugs acting on mitochondria. Mitochondrion. 13 (3), 199-208 (2013).
- Ubah, O. C., Wallace, H. M. Cancer therapy: Targeting mitochondria and other sub-cellular organelles. Current Pharmaceutical Design. 20 (2), 201-222 (2014).
- Yamaguchi, R., et al. Efficient elimination of cancer cells by deoxyglucose-ABT-263/737 combination therapy. PLoS One. 6 (9), 24102 (2011).
- Hahn, T., et al. Use of anti-cancer drugs, mitocans, to enhance the immune responses against tumors. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (3), 357-376 (2013).
- Panina, S. B., Pei, J., Baran, N., Konopleva, M., Kirienko, N. V. Utilizing Synergistic Potential of Mitochondria-Targeting Drugs for Leukemia Therapy. Frontiers in Oncology. 10, 435 (2020).
- Lema, C., Varela-Ramirez, A., Aguilera, R. J. Differential nuclear staining assay for high-throughput screening to identify cytotoxic compounds. Current Cellular Biochemistry. 1 (1), 1-14 (2011).
- Döhner, H., et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood. 115 (3), 453-474 (2010).
- Heinz, S., et al. Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation. Scientific Reports. 7, 45465 (2017).
- Fan, T., et al. Tumor Energy Metabolism and Potential of 3-Bromopyruvate as an Inhibitor of Aerobic Glycolysis: Implications in Tumor Treatment. Cancers (Basel). 11 (3), (2019).
- Pal, R., Mamidi, M. K., Das, A. K., Bhonde, R. Diverse effects of dimethyl sulfoxide (DMSO) on the differentiation potential of human embryonic stem cells. Archives of Toxicology. 86 (4), 651-661 (2012).
- Tunçer, S., et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Scientific Reports. 8 (1), 14828 (2018).
