Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität
Summary
Das Protokoll beschreibt einen schnellen, hohen Durchsatz, zuverlässigen, kostengünstigen und unvoreingenommenen Test zur effizienten Bestimmung der Zelllebensfähigkeit. Dieser Test ist besonders nützlich, wenn die Mitochondrien der Zellen geschädigt wurden, was andere Assays stört. Der Test verwendet die automatisierte Zählung von Zellen, die mit zwei Kernfarbstoffen – Hoechst 33342 und Propidiumiodid – befleckt sind.
Abstract
Der Beitrag der Mitochondrien zur onkogenen Transformation ist ein Thema von großem Interesse und aktiver Studie. Da das Feld des Krebsstoffwechsels komplexer wird, wird das Ziel, Mitochondrien mit verschiedenen Verbindungen anzugreifen, die mitochondriale Schäden verursachen (sogenannte Mitocans), immer beliebter. Leider benötigen viele bestehende Zytotoxizitätstests, wie z. B. solche, die auf Tetrazoliumsalzen oder Resazurin basieren, funktionelle mitochondriale Enzyme für ihre Leistung. Der Schaden, der durch Verbindungen verursacht wird, die auf Mitochondrien abzielen, beeinträchtigt oft die Genauigkeit dieser Assays. Hier beschreiben wir ein modifiziertes Protokoll, das auf Differentialfärbung mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen basiert, von denen einer zellpermeant (Hoechst 33342) und der andere nicht (Propidiumiodid) ist. Der Unterschied in der Färbung ermöglicht es, lebende und abgestorbene Zellen zu diskriminieren. Der Assay ist für die automatisierte Mikroskopie und Bildanalyse zugänglich, was den Durchsatz erhöht und Verzerrungen reduziert. Dies ermöglicht auch die Verwendung des Assays in High-Throughput-Manier mit 96-Well-Platten, so dass es eine praktikable Option für Drogenentdeckungbemühungen, vor allem, wenn die betreffenden Medikamente haben ein gewisses Maß an Mitotoxizität. Wichtig ist, dass die Ergebnisse des Hoechst/PI-Färbetestes eine erhöhte Konsistenz aufweisen, sowohl mit Trypan-Blau-Ausschlussergebnissen als auch zwischen biologischen Replikationen, wenn der Test mit anderen Methoden verglichen wird.
Introduction
Der erste Schritt zur Identifizierung wirksamer Krebsbehandlungen ist die Auswahl eines robusten, unvoreingenommenen Zytotoxizitäts-Assays, der verwendet werden kann, um die Wirkung der Behandlung zu untersuchen. Eine häufige Wahl für Versuche mit niedrigem Durchsatz ist der Ausschluss von Trypan-Blaufarbstoff enthäupfen zellendes. Diese Methode wird bevorzugt, weil sie eine relativ unvoreingenommene Methode zur Quantifizierung des Zellüberlebens ermöglicht. Trypan blau diffundiert passiv in Zellen, deren Membranen kompromittiert sind, aber es wird effektiv daran gehindert, in gesunde Zellen einzudringen1. Der Quotient der lebenden Zellen und der Gesamtzellen stellt die prozentuale Lebensfähigkeit dar, was auf die Wirksamkeit der Behandlung hinweist. Der größte Nachteil des Trypan-Blau-Assays ist, dass er für Methoden mit hohem Durchsatz schlecht geeignet ist. Es hat ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis und längere Färbung kann zu Artefakten aufgrund der Färbung lebensfähiger Zellen führen. Folglich wird Trypan-Blau-Ausschluss in der Regel, aber nicht immer2, auf manuelle Zählung reduziert. Dies macht es zu langsam und führt die starke Möglichkeit der Voreingenommenheit aufgrund der subjektiven Beurteilung des Forschers (es sei denn, blendende oder unabhängige Zählungen verwendet werden, die den Labordurchsatz weiter reduzieren). Im Allgemeinen ist der Durchsatz dieses Assays nicht ausreichend für die moderne Entdeckung von Medikamenten.
Viability Assays, die im Allgemeinen einen viel höheren Durchsatz haben, ermöglichen es forschern, diese Einschränkung zu umgehen, haben aber erhebliche Vorbehalte (siehe Tabelle 1). Diese Methoden lassen sich in der Regel in zwei Gruppen unterteilen. Eine Gruppe besteht aus kolorimetrischen Assays, die auf der Funktion zellulärer Redoxenzyme basieren. Farblose oder nicht fluoreszierende Substrate werden in lebendige Produkte umgewandelt, die mit einem Spektralphotometer quantifiziert werden können. Klassische Beispiele sind Tetrazoliumsalze (MTT, WST-1, XTT, etc.) und Resazurin. Diese Kategorie umfasst auch lumineszierende Assays, die Luziferin verwenden, um ATP-Niveau zu bewerten. Assays dieser Art haben die zugrunde liegende Einschränkung, dass sie den Zellstoffwechsel messen, was nicht die zelluläre Lebensfähigkeit per se ist. Es ist durchaus üblich, dass Zellen unter widrigen Bedingungen still werden, aber immer noch die Fähigkeit behalten,3,4,5zu teilen. Zum Beispiel, Krebsstammzellen sind oft relativ metabolischruhend 6,7,8,9, und sind wahrscheinlich schwierig, mit diesen Techniken zu assay. Die Wirksamkeit von Behandlungen, die die mitochondriale Funktion schädigen, wie die meisten Mitocans, wird wahrscheinlich ebenfalls deutlich überschätzt.
Eine alternative Methode nutzt die chemischen Eigenschaften verschiedener Substanzen, die es ihnen ermöglichen, biologische Membranen entweder zu kreuzen oder nicht. Ein Beispiel sind nukleare Flecken wie SYTOX oder Propidiumiodid (PI). Diese Kategorie umfasst auch Assays, die im Konzept ähnlich sind, aber in ihrer Funktion unterschiedlich sind, wie z. B. der Lactatdehydrogenase (LDH)-Assay, der die Freisetzung von LDH in das extrazelluläre Milieu als Indikator für zelluläre Nekrose misst (Abbildung 1,Tabelle 1). Diese Assays sind eher in der Lage, zwischen metabolisch inaktiven und abgestorbenen Zellen zu unterscheiden.
| Assay/Farbstoff | Typ(e) des zelltoten Todes erkannt | Notwendige Ausrüstung | Hauptmerkmale |
| MTT, CKK-8, Alamar Blue (Resazurin) | Apoptose/Nekrose | Spektrophotometer | Preiswert, schnell; Endpunkt-Assay; abhängig von der Enzymaktivität (ausschließlich mitochondrial bei MTT) und unterscheidet nicht zwischen den Arten des Zelltodes1,10 |
| LDH-Freigabe | Nekrose | Spektrophotometer | Schnell, unabhängig von der Aktivität mitochondrialer Enzyme; teuer für Tests mit hohem Durchsatz; erkennt nekrotische Zellen mit compromisierter Plasmamembran11,12 |
| Trypan Blue (TB) | Apoptose/Nekrose | Mikroskop | Zellimpermeant; unterscheidet nicht zwischen den Arten des Zelltodes; mühsam und nicht geeignet für Hochdurchsatz-Screening; schwieriger zu verwenden mit anhaftenden Zellen; anfällig für subjektive Beurteilung des Anwenders, gilt aber als Standard-Zelllebensfähigkeitsmessmethode13 |
| Acridine orange (AO) | Apoptose/Nekrose/ | Fluoreszenzmikroskop | Ein Nukleinsäurefarbstoff mit einzigartigen spektralen Eigenschaften kann zwischen Apoptose und Nekrose/Nekroroptose14 unterscheiden |
| Nekrotose | |||
| Hoechst 33342, DAPI | Apoptose | Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer | Zelldurchlässig; für sich allein ungeeignet, den Zelltod zu überwachen; nützlich für die Co-Färbung; kann verwendet werden, um Chromatinkondensation und Kernfragmentierung bei früher Apoptose zu bewerten; kann mit Propidiumjodid gepaart werden, um Apoptose von Nekrose zu unterscheiden15,16 |
| Propidium Iodid (PI) | Späte Apoptose/Nekrose | Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer | Zellimpermeant Intercalator; erkennt sowohl späte Apoptose als auch Nekrosemodi des Zelltodes17. Giftig und durchlässig nach langen Inkubationszeiten18 |
Tabelle 1. Liste der Zytotoxizitäts-Assays. Cytotoxizität-Assays, von denen einige in dieser Studie verwendet wurden, wurden zusammen mit der kurzen Beschreibung ihrer wichtigsten Merkmale aufgeführt.
Jüngste Studien haben gezeigt, dass der mitochondriale Stoffwechsel bei einigen Krebsarten verändert wird19,20,21,22,23,24,25. Zum Beispiel, akute myeloische Leukämien (AML) haben gezeigt, dass ihre mitochondriale Masse, mtDNA-Gehalt und mitochondriale Atmung zu upregulieren, um ihre Energieanforderungen zu erfüllen19,26,27. Auf der anderen Seite sind einige solide Tumoren durch mitochondriale Dysfunktion, oder besser gesagt “metabolische Reprogrammierung”, wie Downregulation von mitochondrialen Proteinen in OXPHOS beteiligt oder verminderte mtDNA-Gehalt, die mit Tumor-Invasivität, metastasierendem Potenzial und Resistenz gegen Apoptose-induzierende Medikamente verbunden ist28,29. Darüber hinaus hat in letzter Zeit ein erhöhtes Interesse an der Verwendung mechanistisch vielfältiger Verbindungen, die mitochondriale Funktion beeinflussen (im Allgemeinen mitocans30genannt), als mögliche Therapien für bestimmte Krebsarten. Diese Medikamente zielen auf ATP-Synthese, mitochondriale DNA, OXPHOS, und ROS-Produktion, sowie pro-apoptotische und anti-apoptotische Proteine im Zusammenhang mit Mitochondrien30,31. Mehrere Studien haben gezeigt, dass dieser Ansatz hat erhebliche Versprechen19,32,33,34. Diese metabolischen Abweichungen in der Krebszellbiologie oder mitochondrien-targeting-Behandlungen können jedoch die konventionellen Lebensfähigkeitstests, die auf mitochondrialer Funktionalität basieren, signifikant beeinflussen.
Hier wird ein optimiertes Protokoll für einen differenziellen kerniellen Färbetest beschrieben. Das Protokoll ermöglicht eine schnelle und genaue Bestimmung der Zytotoxizität von Mitocanen oder deren Kombinationen mit anderen Verbindungen. Hoechst 33342 ist ein zellpermeant Kernfarbstoff, der Zellmembranen leicht kreuzt, um DNA zu färben, so dass die Gesamtzellzahl ermittelt werden kann. Durch die Co-Färbung mit PI, die nur in die Kerne abgestorbener Zellen eindringt, kann der Anteil der lebenden (nur Hoechst) und toten (mit beiden) Zellen genau bestimmt werden. Dieses Protokoll verfeinert den veröffentlichten Assay35 durch Hinzufügen eines Schritts zur Optimierung der Farbstoffkonzentration (durch Querverweise mit orthogonalen Trypan-Blau-Verfahrens) und Zentrifugieren der Platte vor der Bildgebung. Da viele Zelllinien halbhaft oder suspendiert sind, erhöht die Zentrifugation den Anteil der abgebildeten Zellen und verbessert die Genauigkeit erheblich. Der Test hat mehrere Vorteile, einschließlich, dass Färbung nicht die Entfernung von Medien oder Waschen erfordert. Die Farbstoffmischung ist auch kostengünstig, einfach zu zubereiten und kompatibel mit Mehrkanal-/Roboter-Pipettiersystemen.
Nachdem Zellen gefärbt wurden, werden sie mit einem automatisierten Mikroskop abgebildet. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, eine permanente Aufzeichnung der Bilder zu erstellen, die später neu analysiert werden kann und die Auswirkungen bestimmter Verbindungen können durch visuelle Inspektion von aufgenommenen Bildern neu bewertet werden. Sobald Bilder erhalten wurden, können Zellen entweder manuell oder mithilfe eines von mehreren Softwarepaketen gezählt werden, einschließlich freier (z. B. ImageJ, CellProfiler, etc.) und kommerzieller Software (z. B. Metamorph, Gen5 usw.). Automatisierte Zellzählung ist im Allgemeinen vorzuziehen, da ordnungsgemäß entwickelte automatisierte Zellzählpipelines genauer und weniger verzerrt sind als manuelle Zählungen. Sie ignorieren auch leichter Zellablagerungen oder unlösliche Komplexe. Die Entwicklung dieser Rohrleitungen ist im Allgemeinen einfach und wird durch die Effizienz der verwendeten Flecken vereinfacht. Die Ausgabe ist quantitativ, da die tatsächliche Anzahl der abgestorbenen Zellen automatisch in Bezug auf die Gesamtzahl der Zellen berechnet wird und verschiedene Schwellenwerte angewendet werden können, um die Stringenz der Erkennung zu erhöhen oder zu verringern35. Für den Komfort sind optimierte Parameter für das Zählen von Zellen mit Gen5 v. 3.00 softwarekompatiblem Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl das Protokoll für Hoechst/PI Cytotoxizität-Assay robust ist und vergleichsweise wenig Hands-on-Zeit erfordert, gibt es mehrere experimentelle Details, die sehr wichtig sind, um genaue Ergebnisse zu gewährleisten. Zunächst ist darauf zu achten, dass die DMSO-Konzentration unter 0,5 % (v/v) bleibt. Es ist allgemein vereinbart, dass die Exposition gegenüber selbst niedrigen Dosen von DMSO die Morphologie und Anhaftung von Zellen wesentlich verändern und die Zellzyklusprogression signifikant verzögern kann<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NVK, ein CPRIT-Stipendiat in der Krebsforschung, dankt dem Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) für die großzügige Unterstützung, CPRIT-Stipendium RR150044. Diese Arbeit wurde auch durch den Welch Foundation Research Grant C-1930 und von den National Institutes of Health R35 GM129294 an NVK verliehen. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Studiengestaltung, Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose/2-DG | Chem-Impex | 50-519-067 | |
| 3-bromo-pyruvate | Alfa Aesar | 1113-59-3 | |
| 96-Well plates | Greiner Bio-One | 655090 | Black or clear flat-bottomed 96-well plates |
| Alamar blue HS cell viability reagent (100mL) | Thermo Fisher | A50101 | |
| Countess II automated cell counter | Thermo Fisher | ||
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | ||
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | 62249 | 20 mM solution; final concentration 1:1,000 |
| HyClone fetal bovine serum | GE Healthcare | #25-514 | |
| m-chlorophenylhydrazone/CCCP | Sigma Aldrich | C2759 | |
| PBS tablets | Thermo Fisher | BP2944100 | 1 tablet + 200 mL of sterile water = 1x PBS solution |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Gibco | 10378016 | |
| Pierce LDH assay kit | Thermo Fisher | 50-103-5952 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher | 50-596-072 | Dry powder; stock 1 mg/mL in PBS; final concentration 5 µg/mL (leukemia cells), 1 µg/mL (normal PBMCs) |
| Rotenone | Ark Pharm | AK115691 | |
| RPMI-1640 Medium With L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
Sigma Aldrich | R8758-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | ACROS Organics | AC158990010 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Cell lines | |||
| K562 | ATCC | CCL-243 | CML cell line |
| MOLM-13 | ATCC | AML cell line |
|
| MOLT-4 | ATCC | CRL-1582 | ALL cell line |
| OCI-AML2 | ATCC | AML cell line |
|
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