מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.
Abstract
אינטראקציות חלבון-חלבון במערכות קרום התא ממלאות תפקידים מכריעים במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים, החל מאינטראקציות בין תא לתא ועד העברת אותות; החל מחישה של אותות סביבתיים ועד לתגובה ביולוגית; מוויסות מטבולי לבקרה התפתחותית. מידע מבני מדויק של אינטראקציות חלבון-חלבון חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים של קומפלקסים של חלבוני ממברנה ולעיצוב מולקולות ספציפיות מאוד לווסת חלבונים אלה. גישות רבות in vivo ו- in vitro פותחו לגילוי וניתוח של אינטראקציות חלבון-חלבון. ביניהם הגישה הביולוגית המבנית היא ייחודית בכך שהיא יכולה לספק מידע מבני ישיר של אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית. עם זאת, הביולוגיה המבנית של חלבון הממברנה הנוכחי עדיין מוגבלת במידה רבה לשיטות מבוססות חומר ניקוי. החיסרון העיקרי של שיטות מבוססות חומר ניקוי הוא שהם לעתים קרובות לנתק או denature קומפלקסים חלבון קרום פעם הסביבה המקומית שלהם bilayer השומנים מוסר על ידי מולקולות דטרגנט. פיתחנו מערכת ננו-חלקיקים של קרום התא המקומי לביולוגיה מבנית של חלבון קרום. כאן, אנו מדגימים את השימוש במערכת זו בניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון על קרום התא עם מקרה מבחן של המצב האוליגומרי של AcrB.
Introduction
אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי1. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.
יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים5. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.
חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד11. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)12 בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)13 שדווחה בעבר.
SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH14. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Åרזולוציה 12,15. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.
טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli12. ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג’ל כחול יליד16. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי16. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות17,18,19,20.
לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs12. באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs12. בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי21. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.
כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
אינטראקציות חלבון חלבון חשובות לשלמות המבנה והתפקוד של חלבוני ממברנה. גישות רבות פותחו כדי לחקור אינטראקציות חלבון חלבון. בהשוואה לחלבונים מסיסים, חלבוני ממברנה ו- PPIs שלהם קשה יותר ללמוד בשל המאפיינים המהותיים הייחודיים של חלבוני ממברנה. קושי זה נובע בעיקר מהדרישה של חלבוני ממברנה להיות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי קרן הסטארט-אפ VCU (לי.ג.) והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01GM132329 (ל- Y.G.) התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים למונטסראט סאמסו וקווין מקרוברטס על תמיכתם הנדיבה בהקלטת וידאו.
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Huang, H., Bader, J. S. Precision and recall estimates for two-hybrid screens. Bioinformatics. 25 (3), 372-378 (2009).
- Serebriiskii, I. G., Golemis, E. A. Two-hybrid system and false positives. Approaches to detection and elimination. Methods in Molecular Biology. 177, 123-134 (2001).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 8 (8), 645-654 (2007).
- Ngounou Wetie, A. G., et al. Investigation of stable and transient protein-protein interactions: Past, present, and future. Proteomics. 13 (3-4), 538-557 (2013).
- Schaufele, F. Maximizing the quantitative accuracy and reproducibility of Forster resonance energy transfer measurement for screening by high throughput widefield microscopy. Methods. 66 (2), 188-199 (2014).
- Berney, C., Danuser, G. FRET or no FRET: a quantitative comparison. Biophysical Journal. 84 (6), 3992-4010 (2003).
- Almen, M. S., Nordstrom, K. J., Fredriksson, R., Schioth, H. B. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin. BMC Biology. 7, 50 (2009).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there. Nature Reviews in Drug Discovery. 5 (12), 993-996 (2006).
- Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Overduin, M., Esmaili, M. Memtein: The fundamental unit of membrane-protein structure and function. Chemistry and Physics of Lipids. 218, 73-84 (2019).
- Qiu, W., et al. Structure and activity of lipid bilayer within a membrane-protein transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 115 (51), 12985-12990 (2018).
- Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. Journal of the American Chemical Society. 131 (22), 7484-7485 (2009).
- Xue, M., Cheng, L., Faustino, I., Guo, W., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Lipid Nanodisk Formation by Styrene-Maleic Acid Copolymers. Biophysical Journal. 115 (3), 494-502 (2018).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica and Biophysica Acta Biomembrames. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Yu, L., Lu, W., Wei, Y. AcrB trimer stability and efflux activity, insight from mutagenesis studies. PLoS One. 6 (12), 28390 (2011).
- Broussard, J. A., Rappaz, B., Webb, D. J., Brown, C. M. Fluorescence resonance energy transfer microscopy as demonstrated by measuring the activation of the serine/threonine kinase Akt. Nature Protocols. 8 (2), 265-281 (2013).
- Ma, L., Yang, F., Zheng, J. Application of fluorescence resonance energy transfer in protein studies. Journal of Molecular Structure. 1077, 87-100 (2014).
- Sachl, R., Humpolickova, J., Stefl, M., Johansson, L. B., Hof, M. Limitations of electronic energy transfer in the determination of lipid nanodomain sizes. Biophysical Journal. 101 (11), 60-62 (2011).
- Woehler, A., Wlodarczyk, J., Neher, E. Signal/noise analysis of FRET-based sensors. Biophysical Journal. 99 (7), 2344-2354 (2010).
- Wang, Z., et al. Comparison of in vitro and in vivo oligomeric states of a wild type and mutant trimeric inner membrane multidrug transporter. Biochemical and Biophysical Reports. 16, 122-129 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. Journal of Visualized Experiments. (132), e57199 (2018).
- Lu, W., Zhong, M., Wei, Y. Folding of AcrB Subunit Precedes Trimerization. Journal of Molecular Biology. 411 (1), 264-274 (2011).
- Lebon, G. . Structure and Function of GPCRs. , 229-230 (2019).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: a high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Lee, S. C., et al. A method for detergent-free isolation of membrane proteins in their local lipid environment. Nature Protocols. 11 (7), 1149-1162 (2016).
- Hall, S. C. L., et al. An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles. Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).
- Oluwole, A. O., et al. Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer. Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).
