Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análisis de interacción proteína-proteína de membrana
Summary
Aquí se presenta un protocolo para la determinación del estado oligomérico de las proteínas de membrana que utiliza un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa junto con microscopía electrónica.
Abstract
Las interacciones proteína-proteínas en los sistemas de membrana celular desempeñan un papel crucial en una amplia gama de procesos biológicos, desde interacciones de célula a célula hasta transducción de señal; desde la detección de señales ambientales hasta la respuesta biológica; desde la regulación metabólica hasta el control del desarrollo. La información estructural precisa de las interacciones proteína-proteína es crucial para comprender los mecanismos moleculares de los complejos de proteínas de membrana y para el diseño de moléculas altamente específicas para modular estas proteínas. Se han desarrollado muchos enfoques in vivo e in vitro para la detección y análisis de interacciones proteína-proteína. Entre ellos, el enfoque de biología estructural es único, ya que puede proporcionar información estructural directa de las interacciones proteína-proteína a nivel atómico. Sin embargo, la biología estructural actual de las proteínas de membrana todavía se limita en gran medida a los métodos basados en detergente. El principal inconveniente de los métodos basados en detergente es que a menudo se desvinculan o desnaturen complejos de proteínas de membrana una vez que su entorno nativo de bicapa lipídica es eliminado por moléculas de detergente. Hemos estado desarrollando un sistema nativo de nanopartículas de membrana celular para la biología estructural de proteínas de membrana. Aquí, demostramos el uso de este sistema en el análisis de interacciones proteína-proteína en la membrana celular con un caso de estudio del estado oligomérico de AcrB.
Introduction
Las interacciones proteína-proteínas (PPI) desempeñan un papel fundamental a lo largo de la biología, desde el mantenimiento de la estructura y la función de las proteínas hasta la regulación de sistemas enteros. Los IBP vienen en muchas formas diferentes y se pueden categorizar en función de qué tipos de interacciones forman. Una de estas categorizaciones es homoolímera o heteroolímera, basada en si las interacciones están entre subunidades idénticas o diferentes proteínas que actúan como subunidades. Otra categorización se basa en la fuerza de la interacción si las interacciones conducen a la formación de complejos estables o estados complejos transitorios. La información estructural sobre los IBP entre proteínas es crucial para comprender el mecanismo por el cual las proteínas llevan a cabo su función. Se ha estimado que más del 80% de las proteínas dependen de una formación compleja para llevar a cabo sus funciones funcionales1. Dado que el porcentaje de proteínas observadas que dependen de los IBP para un funcionamiento innato adecuado, su importancia en la biología es fácilmente evidente, sin embargo, ser capaz de investigar adecuadamente las proteínas que participan en estas interacciones ha seguido siendo un desafío debido a las limitaciones en las técnicas disponibles para observar experimentalmente cuando las proteínas están formando IBP.
Existe un alto grado de desacuerdo entre los resultados de muchos IBP determinados experimentalmente debido a la alta cantidad de ruido, falsos positivos y falsos negativos que se derivan de muchas de las técnicas de determinación de IBP disponibles actualmente. Esto es particularmente así para el sistema de dos híbridos de levadura (Y2H), la afinidad tándem purificación-espectrometría de masas (TAP-MS), y la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET), que representan tres de los métodos más utilizados para la determinación PPI2,3,4,5,6,7. En comparación, las técnicas de biología estructural de proteínas, como la resonancia magnética nuclear (RMN), la cristalografía por rayos X y la microscopía electrónica (EM), se pueden utilizar para obtener información estructural de alta resolución sobre las interacciones proteína-proteína hasta el nivel atómico y permitir la confirmación visual directa de las interacciones que se producen para una proteína objetivo de interés. Todas las técnicas de investigación de determinación de IBP no basadas en estructura disponibles actualmente (por ejemplo, Y2H, TAP-MS y FRET) carecen de esta capacidad y, además, sufren dificultades para identificar interacciones débiles y transitorias entre proteínas5. Estas deficiencias se mejoran aún más al estudiar las proteínas de membrana debido a la complejidad añadida provocada por la variable adicional del entorno lipídico que influye en la formación de una estructura cuaternaria adecuada y un conjunto complejo heteromérico.
Las proteínas de membrana constituyen una gran porción del proteoma y se sabe que desempeñan muchos papeles cruciales en el correcto funcionamiento celular dentro de todos los organismos vivos. A pesar del hecho de que se estima que las proteínas de membrana constituyen el 27% del genoma humano y constituyen ~60% de todos los objetivos de fármacos actuales hay una anomalía importante en el número de modelos resueltos para proteínas de membrana que representan sólo ~ 2.2% de todas las estructuras proteicas publicadas8,9,10. La principal causa de la discrepancia en la disponibilidad de información estructural radica en las propiedades intrínsecas de las propias proteínas de las membranas. Debido a su escasa solubilidad, la dependencia de las interacciones con un entorno lipídico para mantener la estructura y la función nativas, y varias propiedades fisicoquímicas de la propia membrana lipídica, las proteínas de membrana siguen representando un problema sustancial a la hora de implementar técnicas de biología estructural para estudiarlas. De estas propiedades intrínsecas, la más importante para obtener información estructural precisa es el requisito de tener interacciones con su entorno lipídico natural para que mantengan su estructura y función nativas. El entorno lipídico es una parte tan integral de la estructura y función de las proteínas de membrana que el concepto de memteína (una combinación de las palabras membrana y proteína) se ha propuesto como la unidad fundamental de la estructura de la membrana-proteína y la función11. A pesar de la importancia de las interacciones lipídica-proteicas, las técnicas de determinación de IBP basadas en estructura disponibles actualmente a menudo requieren que las proteínas que se están estudiando sean solubles o sean solubilizadas con detergentes. La exposición a detergentes agresivos puede desnaturalizar las proteínas o causar falsos positivos y negativos debido a la deslipidación, que puede inducir agregación, desnaturalización de proteínas, disociación de interacciones no covalentes y formación de estados oligoméricos artificiales. Debido a la necesidad de mantener un entorno lipídico natural para la determinación precisa del estado oligomérico nativo de las proteínas de membrana hemos desarrollado un sistema de nanopartículas de membrana celular nativa (NCMNs)12 basado en el método anteriormente reportado Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13.
SMALP utiliza copolímero de ácido masculino de estireno como polímero activo de membrana para extraer y solubilizar proteínas de membrana. Poly(Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) es un polímero anfifílico único debido a su mitad de estireno hidrofóbico y la mitad de ácido cólico hidrófilo diametralmente opuesto. Forma nanopartículas adsorbándose, desestabilizando e interrumpiendo la membrana celular en un mecanismo dependiente del pH14. Esta actividad funcional de SMA es lo que permite su uso como un sistema libre de detergente para la extracción y solubilización de proteínas de membrana. El sistema NCMN es distinto del sistema SMALP en varios aspectos. La característica más singular del sistema NCMN es que cuenta con una biblioteca de polímeros activos por membrana con una multitud de polímeros que tienen propiedades únicas que los hacen adecuados para el aislamiento de muchas proteínas de membrana diferentes que requieren diferentes condiciones de estabilidad y funcionamiento nativo. El sistema NCMN también tiene diferentes protocolos en comparación con el método SMALP cuando se trata de preparar las nanopartículas. Un ejemplo de este tipo es que las NCMN utilizan una purificación de columna de afinidad de níquel de un solo paso para la determinación de estructura de alta resolución; el efecto de estos diferentes protocolos puede observarse al comparar el protocolo NCMNs, que generó estructuras AcrB crio-EM de 3.2 y 3.0 Å, con un estudio similar utilizando el método SMALP, que dio lugar a una estructura crio-EM AcrB en una resolución de 8,8 Å12,15. Estas características únicas del sistema NCMN son las mejoras realizadas en el método SMALP previamente establecido y lo convierten en un candidato ideal para el estudio de las IBP.
El transportador de eflujo multirresistente AcrB existe como homotrimero funcional en E. coli12. Un análisis mutagénico sugirió que una sola mutación de punto P223G, situada en un bucle que es responsable de la estabilidad del recortador AcrB, desestabiliza el estado del recortador y produce un monómero AcrB cuando se prepara con el DDM detergente, que podría detectarse con electroforesis de gel azul nativo16. Sin embargo, el análisis FRET del mutante AcrB-P223G sugirió que cuando estaba en el entorno de bicapa lipídica de membrana celular nativa, la mayoría de los AcrB-P223G mutantes todavía existían como recortador y que los niveles de expresión tanto para el tipo salvaje AcrB como para AcrB-P223G son similares. Sin embargo, a pesar de los resultados del análisis FRET, un ensayo de actividad para el transportador mutante mostró que la actividad disminuyó drásticamente en comparación con el tipo salvaje16. Aunque la tecnología FRET se ha utilizado popularmente para el análisis de interacciones proteína-proteína, la investigación ha demostrado que con frecuencia puede dar falsos positivos17,18,19,20.
Recientemente, se determinaron estructuras crio-EM de alta resolución del recortador AcrB que mostraron la interacción de AcrB con su bicapa lipídica de membrana celular nativa asociada mediante el uso de los NCMN12. En principio, las NCMN se pueden utilizar fácilmente para el análisis de las interacciones proteína-proteína que se encuentran en la membrana celular nativa. En una prueba de este sistema, se llevaron a cabo experimentos para observar directamente el estado oligomérico de AcrB-P223G con el uso de nanopartículas de membrana celular nativa y microscopía electrónica de tinción negativa. Con el fin de comparar con las nanopartículas AcrB de tipo salvaje, utilizamos el mismo polímero activo de membrana (SMA2000 fabricado en nuestro laboratorio, que se indexa como NCMNP1-1 en la biblioteca NCMN) utilizado para la determinación de estructura crio-EM de alta resolución de AcrB y polímeros alternativos que se encuentran en la biblioteca NCMNs12. Sobre la base de los resultados previamente reportados, se esperaba que la mayoría del mutante AcrB-P223G existiría en forma de nanopartículas de membrana celular nativa trimértica21. Sin embargo, no se encontraron recortadores AcrB presentes en la muestra, como los que se observaron con el tipo salvaje AcrB. Esto sugiere que la mayoría de AcrB-P223G no forma recortadores en la membrana celular nativa como se sugirió anteriormente.
Aquí informamos de un análisis detallado del mutante E. coli AcrB-P223G en una comparación con el tipo salvaje E. coli AcrB usando los NCMN. Este caso de estudio de AcrB sugiere que las NCMN son un buen sistema para el análisis de interacción proteína-proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las interacciones proteína-proteínas son importantes para la integridad de la estructura y la función de las proteínas de membrana. Se han desarrollado muchos enfoques para investigar las interacciones proteína-proteínas. En comparación con las proteínas solubles, las proteínas de membrana y sus IBP son más difíciles de estudiar debido a las propiedades intrínsecas únicas de las proteínas de membrana. Esta dificultad proviene principalmente del requisito de que las proteínas de membrana se incrusen en un e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el fondo de startups VCU (a Y.G.) y el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R01GM132329 (a Y.G.) El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Agradecemos a Montserrat Samso y Kevin McRoberts por su generoso apoyo a la grabación de vídeo.
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
References
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