Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

Résumé

L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Résumé

Un NM biomimétique a été développé pour servir d’échafaudage biologique d’ingénierie tissulaire, qui peut améliorer l’ancrage des cellules souches. Le NM biomimétique est formé à partir de JBNTs et FN par auto-assemblage dans une solution aqueuse. Les JBNT mesurent de 200 à 300 μm de longueur avec des canaux creux hydrophobes intérieurs et des surfaces hydrophiliques extérieures. Les JBNT sont facturés positivement et les NF sont facturés négativement. Par conséquent, lorsqu’ils sont injectés dans une solution aqueuse neutre, ils sont collés entre eux par liaison non rentable pour former les faisceaux NM. Le processus d’auto-assemblage est terminé en quelques secondes sans aucun initiateur chimique, source de chaleur ou lumière UV. Lorsque le pH de la solution NM est inférieur au point isoélectrique des FN (pI 5.5-6.0), les faisceaux NM s’auto-libèrent en raison de la présence d’un FN chargé positivement.

NM est connu pour imiter la matrice extracellulaire (ECM) morphologiquement et, par conséquent, peut être utilisé comme un échafaudage injectable, qui fournit une excellente plate-forme pour améliorer l’adhérence hMSC. L’analyse de la densité cellulaire et les expériences d’imagerie par fluorescence ont indiqué que les MR augmentaient considérablement l’ancrage des HMC par rapport au contrôle négatif.

Introduction

Les cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs) ont montré le potentiel d’auto-renouvellement et d’auto-différenciation le long de différentes lignées mésenchymales, ce qui contribue à la régénération et à l’entretien des^{tissus 1}. Basé sur le potentiel de différenciation, hMSCs sont considérés comme candidats pour des dommages mésenchymal de tissu et thérapie hématopoietic^{de désordre 2.} HMSCs ont montré la capacité de favoriser la guérison des plaies en augmentant la réparation des tissus, l’angiogenèse, et la réduction de l’inflammation³. Toutefois, sans l’aide biochimique ou biomatériaux, l’....

Protocole

1. Synthèse des JBNT

REMARQUE : Le monomère JBNT a été préparé tel qu’il a été^{publié précédemment 11}.

1. Synthèse du composé A1
   1. Préparer une solution contenant 8,50 g d’acide 2-cyanoacétique et 9,80 g d’éthylcarbamate dans 25 mL de toluène et 2,5 mL de N, N-diméthylformamide. Ajouter 4,90 mL de chlorure de phosphoryl dans le sens de la goutte. Chauffer ensuite le mélange à 70 °C et continuer à remuer pendant 1,5 h.
   2. Refroidir le mélange de réaction à température ambiante et verser 100 g d’eau glacée. Extraire la couche aqueuse avec de l’acétate éthylique (3 x 250 mL) et laver avec 100 mL de s....

Résultats

Nos études ont découvert que la formation du NM des JBNT et du FN est rapide, ce qui s’est produit en 10 secondes. Comme le montre la figure 2,la floccule blanche a été obtenue lorsque la solution JBNT a été mélangée à la solution FN et pipetted à plusieurs reprises. Le processus de formation de NM est complètement biomimétique. Aucun stimulus externe n’est nécessaire. Le processus de fabrication est beaucoup plus facile que celui de certains biomatériaux émergents, qui est basé sur la lumiè.......

Discussion

Dans cette étude, nous avons développé un NM biomimétique auto-assemblé, qui a été formé avec des JBNTs inspirés de l’ADN et fn. Lors de la préparation de la solution JBNT, la poudre lyophilisée JBNT devrait être dissoute dans l’eau au lieu de PBS parce que PBS provoquera l’agglomération de JBNTs, ce qui inhibe leur assemblage. En outre, le NM devrait également être assemblé dans l’eau si nous voulons observer les structures nano-fibriles du NM, parce que le sel dans PBS se regroupera avec des fibres NM, ce qui peut rédu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,2-dichloroéthane	Alfa Aesar	39121
Acide 2-cyanoacétique	Sigma-Aldrich	C88505
4-Diméthylaminopyridine	TCI America	D1450
8 puits Couverture à chambre	Thermo Fisher	155409
Plaque à 96 puits	Corning	353072
éthanol	absoluThermo Fisher	BP2818500
acétone	Sigma-Aldrich	179124
acétonitrile	Sigma-Aldrich	34851
allylamine	Sigma-Aldrich	145831
Basic Nettoyant Plasma	Harrick Plasma	PDC32G
Acide citrique	Sigma-Aldrich	251275
concentré acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	H1758
Eau désionisée	Thermo Fisher	15230147
dichlorométhane	Sigma-Aldrich	270997
éther diéthylique	Sigma-Aldrich	296082
dicarbonate de di-tert-butyle	Sigma-Aldrich	361941
acétate d’éthyle	Sigma-Aldrich	319902
éthylcarbamate	Sigma-Aldrich	U2500
Fibronectine	Thermo Fisher	PHE0023
solution fixatrice (formaldéhyde à 4 % préparée dans du PBS)	Thermo Fisher	R37814
chlorhydrate de guanidinium	Alfa Aesar	A13543
hexanes	Sigma-Aldrich	227064
Humain cellules souches mésenchymateuses	Lonza	PT-2501
méthanol	Sigma-Aldrich	34860
iodure de méthyle	Sigma-Aldrich	289566
N,N-diisopropyléthylamine	Alfa Aesar	A17114
N,N-diméthylformamide	Sigma-Aldrich	227056
N-méthylmorpholine N-oxyde	Alfa Aesar	A19802
Tétraoxyde d’osmium	Alfa Aesar	45385
Pénicilline-Streptomycine	Thermo Fisher	15140163
solution tampon de phosphate	Thermo Fisher	20012050
chlorure de phosphoryle	Sigma-Aldrich	201170
carbonate de potassium	Sigma-Aldrich	347825
colonne en phase inverse	Thermo Fisher	25305-154630
Rhodamine Phalloïdine	Thermo Fisher	R415
gel de silice	TCI America	S0821
bicarbonate	de sodium Sigma-Aldrich	S6014
éthoxyde de sodium	Alfa Aesar	L13083
périodide de sodium	Sigma-Aldrich	71859
sulfate de sodium	Sigma-Aldrich	239313
sulfite de sodium	Sigma-Aldrich	S0505
triacétoxyborohydrure de sodium	Alfa Aesar	B22060
spectrophotomètre(NanoDrop One/Onec UV-Vis)	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Croissance de cellules souches BulletKit	Lonza	PT-3001
tétrahydrofurane	Sigma-Aldrich	401757
thioanisole	Sigma-Aldrich	T28002
toluène	Sigma-Aldrich	179418
triéthylamine	Alfa Aesar	A12646
acide trifluoroacétique	Alfa Aesar	A12198
Triton X-100	Thermo Fisher	HFH10
Solution trypsine-EDTA	Thermo Fisher	25200056