Dubbele directe bloedinjectie in de Cisterna Magna als model van subarachnoïdale bloeding

Summary

We beschreven in dit protocol een gestandaardiseerde subarachnoïdale bloeding (SAH) muis model door een dubbele injectie van autologe volbloed in de cisterna magna. De hoge mate van standaardisatie van de dubbele injectieprocedure vertegenwoordigt een midden-tot-acuut model van SAH met relatieve veiligheid met betrekking tot sterfte.

Abstract

Onder beroertes, subarachnoïdale bloeding (SAH) opeenvolgend aan de breuk van een cerebrale arteriële aneurysma vertegenwoordigt 5-9% maar is verantwoordelijk voor ongeveer 30% van de totale beroerte-gerelateerde mortaliteit met een belangrijke morbiditeit in termen van neurologische uitkomst. Een vertraagde cerebrale vasospasme (CVS) kan het vaakst voorkomen in combinatie met een vertraagde cerebrale ischemie. Verschillende dierlijke modellen van SAH worden nu gebruikt, waaronder endovasculaire perforatie en directe injectie van bloed in de cisterna magna of zelfs de prechiasmatische reservoir, die elk verschillende voor- en nadelen vertoont. In dit artikel wordt een gestandaardiseerd muismodel van SAH gepresenteerd door dubbele directe injectie van bepaalde volumes autologe volbloed in de cisterna magna. Kortom, muizen werden gewogen en vervolgens verdoofd door isoflurane inhalatie. Vervolgens werd het dier in een liggende positie op een verwarmde deken geplaatst met een rectale temperatuur van 37 °C en geplaatst in een stereotactisch frame met een cervicale bocht van ongeveer 30°. Eenmaal op zijn plaats werd de punt van een langwerpige glazen micropipet gevuld met het homologe arteriële bloed uit halsslagader van een andere muis van dezelfde leeftijd en geslacht (C57Bl/6J) in een rechte hoek geplaatst in contact met het atlanto-occipitaal membraan door middel van een micromanipulator. Vervolgens werd 60 μL bloed geïnjecteerd in de cisterna magna gevolgd door een 30° neerwaartse kanteling van het dier gedurende 2 minuten. De tweede infusie van 30 μL bloed in de cisterna magna werd 24 uur na de eerste uitgevoerd. De individuele opvolging van elk dier wordt dagelijks uitgevoerd (zorgvuldige evaluatie van gewicht en welzijn). Deze procedure maakt een voorspelbare en zeer reproduceerbare verdeling van bloed mogelijk, waarschijnlijk vergezeld van intracraniale drukhoogte die kan worden nagebootst door een gelijkwaardige injectie van een kunstmatig hersenmergvocht (CSF), en vertegenwoordigt een acuut tot mild-model van SAH die een lage mortaliteit veroorzaakt.

Introduction

Subarachnoïdale bloeding (SAH) is goed voor maximaal 5% van alle beroertegevallen en vormt een relatief veel voorkomende pathologie met een incidentie van 7,2 tot 9 patiënten per 100.000 per jaar, met een sterftecijfer van 20%-60% afhankelijk van de studie^1,2,3. In de acute fase is de mortaliteit toe te schrijven aan de ernst van bloedingen, rebleeding, cerebrale vasospasme (CVS) en/of medische complicaties⁴. Bij overlevenden wordt vroeg hersenletsel (EBI) geassocieerd met parenchymale verlenging van bloeding en abrupte toename van de intracraniale druk, wat kan leiden tot primaire^{hersenaandoeningen 5} en onmiddellijke dood in ongeveer 10%-15% van de gevallen⁶. Na de eerste “acute” fase van SAH, de prognose hangt af van het optreden van “secundaire” of vertraagde cerebrale ischemie (DCI), gedetecteerd bij bijna 40% van de patiënten door cerebrale computertomografie, en in maximaal 80% van de patiënten na magnetische resonantie imaging (MRI)^7,8. Naast de CVS die optreedt tussen 4 tot 21 dagen na aneurysmabreuk bij een meerderheid van SAH-patiënten, kan DCI⁹ het gevolg zijn van multifactoriële diffuse hersenletsels die secundair zijn aan microtrombosevorming, verminderde cerebrale perfusie, neuro-inflammatie en corticale verspreidingsdepressie (CSD)^10,11,12,13. Dit beïnvloedt 30% van SAH overlevenden en effecten cognitieve functies, waaronder visueel geheugen, verbaal geheugen, reactietijd, en uitvoerende, visuospatial en taal functies¹⁴ afbreuk te doen aan het dagelijks leven¹⁵. Huidige standaard therapieën om CVS en/of de slechte cognitieve resultaten bij SAH-patiënten te voorkomen zijn gebaseerd op de blokkade van Ca²⁺ signalering en vasoconstrictie met behulp van Ca²⁺ kanaalremmers als Nimodipine. Echter, meer recente klinische studies gericht op vasoconstrictie bleek dissociatie tussen neurologische uitkomst van de patiënt en preventie van CVS¹⁶, suggereert meer complexe pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij SAH-lange termijn gevolgen. Daarom is er een medische behoefte aan meer begrip van het aantal pathologische gebeurtenissen dat gepaard gaat met SAH en de ontwikkeling van geldige en gestandaardiseerde diermodellen om originele therapeutische interventies te testen.

De breuk van een intracranial aneurysma meestal verantwoordelijk voor SAH bij de mens is waarschijnlijk moeilijk na te bootsen in preklinische diermodellen. Momenteel kan de aneurysmabreuk en SAH-situatie voorlopig worden getest door de perforatie van de middelste hersenslagader (endovasculaire punctiemodel) die verantwoordelijk is voor CVS en sensitivomotorische disfuncties bij muizen^17,18. Door het ontbreken van enige mogelijke controle over het begin van bloeden en de verspreiding van bloed in dit model, zijn andere methoden ontwikkeld bij knaagdieren om SAH-modellen te genereren zonder endovasculaire breuk. Om precies te zijn, ze bestaan uit de directe toediening van arteriële bloed in de subarachnoïdale ruimte door middel van een enkele of een dubbele injectie in de magna cisterna¹⁹ of een enkele injectie in de prechiasmatische recister²⁰. Het belangrijkste voordeel van deze muismodellen zonder endovasculaire breuk is de mogelijkheid om de chirurgische ingreep en de kwaliteit en kwantiteit van het geïnjecteerde bloedmonster reproduceerbaar onder de knie te krijgen. Een ander voordeel van dit model over het model door endovasculaire perforatie in het bijzonder is het behoud van het algemene welzijn van het dier. In feite is deze operatie minder invasief en technisch minder uitdagend dan nodig is om een halsslagader te genereren. In dit laatste model moet het dier worden geïntubeerd en mechanisch geventileerd, terwijl een monofilament in de externe halsslagader wordt ingebracht en in de interne halsslagader wordt gevorderd. Dit leidt waarschijnlijk tot voorbijgaande ischemie als gevolg van obstructie van het vat door het draadpad. Bijgevolg is de comorbiditeit (stervende toestand, belangrijke pijn en dood) geassocieerd met chirurgie minder belangrijk in het model met dubbele injectie in vergelijking met het endovasculaire perforatiemodel. De methode voor dubbele directe injectie is niet alleen een consistentere SAH, maar voldoet niet alleen aan het dierenwelzijn bij onderzoek en testen (kortere tijd onder anesthesie, pijn door weefselverstoring in chirurgie en nood) en leidt tot een minimaal totaal aantal dieren dat wordt gebruikt voor de protocolstudie en personeelstraining.

Bovendien maakt dit de implementatie van hetzelfde protocol voor transgene muizen mogelijk, wat leidt tot een geoptimaliseerd pathologisch begrip van de SAH en de mogelijkheid van vergelijkende tests van potentiële therapeutische verbindingen. Hier presenteren we een gestandaardiseerd muismodel van subarachnoïdale bloeding (SAH) door een dubbele dagelijkse opeenvolgende injectie van autoloog arteriële bloed in de cisterna magna in 6-8 weken oude mannelijke C57Bl/6J muizen. Het belangrijkste voordeel van dit model is de controle van het bloeden volume in vergelijking met de endovasculaire perforatie model, en de versterking van de bloeden gebeurtenis zonder een drastische toename van de intracraniale druk²¹. Onlangs is de dubbele directe injectie van bloed in de cisterna magna goed beschreven op de experimentele en fysiopathologische problemen bij muizen. Inderdaad, we hebben onlangs aangetoond CVS van grote cerebrale slagaders (basilaire (BA), midden (MCA) en voorste (ACA) cerebrale slagaders), cerebrovasculaire fibrin afzetting en cel apoptose van dag 3 (D3) tot 10 (D10), circulatie defecten van paravasculaire cerebrospinale vloeistof vergezeld van veranderde sensibilistische en cognitieve functies in muizen, 10 dagen na-SAH in dit model²². Zo maakt het dit model beheerst, gevalideerd en gekenmerkt voor korte termijn en langdurige gebeurtenissen post-SAH. Het moet bij uitstek geschikt zijn voor toekomstige identificatie van nieuwe doelen en voor studies over krachtige en efficiënte therapeutische strategieën tegen SAH-geassocieerde complicaties.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd onder toezicht van H. Castel overeenkomstig de Franse Ethische Commissie en de richtsnoeren van Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad voor de bescherming van voor wetenschappelijke doeleinden gebruikte dieren. Dit project werd goedgekeurd door de lokale CENOMEXA en de nationale ethische commissies voor dieronderzoek en -testen. Mannelijke C57Bl/6J Rj muizen (Janvier), in de leeftijd van 8-12 weken, werden gehuisvest onder gecontroleerde standaard omgevingsomstandighe…

Representative Results

Experimentele tijdlijn, procedure, follow-up en mortaliteitFiguur 1A en figuur 1B vatten het SAH-modelprotocol samen door een dubbele intracisternale injectie van bloed. Kortom, op de eerste dag van SAH inductie (D-1) werd 60 μL bloed dat uit een homologe muis of 60 μL kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) werd geïnjecteerd in de cisterna magna in respectievelijk SAH of schijnaandoeningen. De volgende dag (D0), 30 μL bloed uit een …

Discussion

Ondanks de intensiteit van het onderzoek op het gebied van SAH en de ontwikkeling van therapeutische strategieën zoals endovasculaire en farmacologische behandelingsopties die in de afgelopen twintig jaar zijn toegenomen , blijft de mortaliteit hoog in de eerste week van de ziekenhuisopname en bereikt het ongeveer 50% tijdens de volgende 6 maanden^24,25. Dit huidige preklinische model door dagelijkse dubbele injectie van homoloog arteriële bloed…

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071