Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Summary

Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Abstract

Les comportements de recherche de nourriture et d’alimentation permettent aux animaux d’accéder à des sources d’énergie et de nutriments essentiels à leur développement, à leur santé et à leur forme physique. L’étude de la régulation neuronale de ces comportements est essentielle pour la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires sous-jacents à l’homéostasie nutritionnelle. L’utilisation de modèles animaux génétiquement tractables tels que les vers, les mouches et les poissons facilite grandement ces types d’études. Au cours de la dernière décennie, la mouche des fruits Drosophila melanogaster a été utilisée comme un modèle animal puissant par les neurobiologistes qui étudient le contrôle neuronal des comportements d’alimentation et de recherche de nourriture. Bien que sans aucun doute précieux, la plupart des études examinent les mouches adultes. Ici, nous décrivons un protocole qui tire parti du système nerveux larvaire plus simple pour étudier les substrats neuronaux contrôlant des comportements d’alimentation lorsque les larves sont exposées à des régimes différents dans leur teneur en protéines et en glucides. Nos méthodes sont basées sur un test quantitatif colorimétrique d’alimentation sans choix, réalisé dans le cadre d’un écran d’activation thermogénétique neuronale. Comme lecture, la quantité de nourriture consommée par les larves sur un intervalle de 1 h a été employée une fois exposée à l’un des trois régimes colorant-marqués qui diffèrent dans leurs rapports protéines aux hydrates de carbone (P:C). L’efficacité de ce protocole est démontrée dans le cadre d’un criblage neurogénétique chez la drosophilelarvaire, en identifiant des populations neuronales candidates régulant la quantité de nourriture consommée dans des régimes de différentes qualité macronutriments. Nous avons également pu classer et regrouper les génotypes testés en classes phénotypiques. Sans compter qu’un bref examen des méthodes actuellement disponibles dans la littérature, les avantages et les limites de ces méthodes sont discutés et, également, quelques suggestions sont fournies au sujet de la façon dont ce protocole pourrait être adapté à d’autres expériences spécifiques.

Introduction

Tous les animaux dépendent d’une alimentation équilibrée pour acquérir les quantités nécessaires à la survie, à la croissance et à la reproduction¹. Le choix de ce que et combien manger est influencé par une multitude de facteurs d’interaction liés à l’état interne de l’animal, comme le niveau de satiété, et les conditions environnementales, telles que la qualité de la nourriture^2,3,4,5. Les protéines et les glucides sont deux macronutriments majeurs et leur apport équilibré est essentiel pour soutenir les processus physiologiques des animaux. Par conséquent, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlant les comportements d’alimentation et soutenant un apport équilibré de ces macronutriments est extrêmement pertinente. C’est parce que les traits du cycle biologique comme la durée de vie, la fécondité et la santé métabolique sont directement affectés par les niveaux d’apport en protéines^6,7,8,9,10.

L’utilisation d’organismes plus simples et plus maniables qui présentent des habitudes alimentaires conservées au cours de l’évolution avec des animaux complexes, y compris des mammifères, est essentielle à ce type d’études. Il est important de faire en 1999, ces modèles animaux plus simples offrent une bonne occasion de disséquer des questions biologiques complexes dans un contexte coûteux, éthiquement et techniquement plus efficace. Au cours des dernières décennies, la drosophile,avec sa puissante boîte à outils génétique, son comportement complexe et stéréotypé et son architecture conservée de mécanismes périphériques et de détection des nutriments avec les mammifères, a été un modèle fructueux pour les neurobiologistes comportementaux¹¹. En fin de compte, l’espoir est qu’en comprenant comment l’apport alimentaire est régulé chez cet animal, avec un système nerveux plus simple, nous pouvons alors commencer à démêler les dysfonctionnements neuronaux sous-jacents aux troubles de l’alimentation humaine.

L’étude des substrats neuronaux pour les comportements alimentaires dépend profondément de la capacité de mesurer simultanément l’apport alimentaire des animaux tout en manipulant leur activité neuronale. En raison des quantités minimales d’aliments ingérés, il est extrêmement difficile de quantifier la quantité d’aliments consommés par les mouches, et toutes les méthodes actuellement disponibles présentent des limites importantes. Ainsi, l’étalon-or est d’utiliser une combinaison de méthodologies complémentaires¹². Les mouches adultes ont été historiquement favorisées comme modèle génétique et comportemental. Néanmoins, les larves de drosophiles offrent également des possibilités d’étudier les substrats neuronaux codant pour le comportement alimentaire. Le système nerveux central (SNC) larvaire, avec environ 12 000 neurones, est nettement moins complexe que celui de l’adulte, qui contient environ 150 000 neurones. Cette complexité inférieure n’est pas seulement numérique mais aussi fonctionnelle, car les comportements larvaires reposent sur des fonctions de locomotive et des systèmes sensoriels plus simples. Malgré l’apparente simplicité de leur système nerveux, les larves présentent encore des comportements alimentaires complets, et certaines méthodes pour quantifier l’ingestion de nourriture chez les larves de drosophiles ont été décrites^5,13,14,15. En s’associant à des manipulations de l’activité neuronale, les larves de drosophiles peuvent constituer un modèle hautement tractable pour comprendre la régulation neuronale de l’apport alimentaire.

Voici un protocole détaillé pour quantifier l’apport alimentaire chez les larves exposées à des régimes alimentaires de différentes qualité de macronutriments. Les régimes, appelés régimes d’équilibrage des macronutriments, différaient par les teneurs en protéines et en glucides, en particulier en ce qui concerne les rapports protéines/glucides (P:C) : 1:1 (régime riche en protéines), 1:4 (régime intermédiaire) et 1:16 (régime pauvre en protéines), comme le montre la figure 1A. Brièvement, une analyse quantitative d’alimentation sans choix a été établie utilisant ces trois régimes basés sur la saccharose-levure isocalorique (SY) teints avec un colorant alimentaire bleu. Étant donné que l’extrait de levure et le saccharose ont été utilisés comme sources de protéines et de glucides, et que les deux contiennent des glucides, la variation des rapports P:C a été obtenue en modifiant l’équilibre de ces deux composants, comme décrit précédemment¹⁶ et comme indiqué à la figure 1B. Un aperçu schématique du protocole, montrant les principales étapes expérimentales, est disponible à la figure 2.

Ce protocole a été établi dans le but d’étudier le rôle des populations neuronales spécifiques sur le règlement des niveaux d’alimentation larvaires dans les régimes de différents rapports de P: C et dans le cadre d’un écran neuronal thermogénétique. Un outil neurogénétique bien caractérisé a été utilisé à partir de la famille du potentiel de récepteur transitoire (TRP): canal de potentiel de récepteur transitoire de la drosophile (dTRPA1), qui est un canal cationique à température et tension fermée, permettant la mise à feu des potentiels d’action lorsque les températures ambiantes s’élèvent au-dessus de 25 ° C¹⁷. Pour exprimer le transgène dTRPA1, nous avons profité des lignéesGal4 basées sur les régions cis-régulatrices du génome de la drosophile, établies dans le laboratoire Rubin, dans le cadre du projet FlyLight au Janelia Research Campus^18,19.

Bien que le protocole, décrit ici, ait été établi dans le cadre d’un écran d’activation, il peut être facilement adapté par l’expérimentateur à d’autres besoins ou intérêts spécifiques, à savoir effectuer un écran de suppression à l’aide du silencieux neuronal sensible à la température ShibireTS^20,en alternative au dTRPA1. Cette adaptation et d’autres sont abordées dans les sections protocole et discussion.

Protocol

1. Préparation des régimes de levure de saccharose (SY) Peser tous les ingrédients secs (gélose, levure, saccharose) pour l’équilibrage des macronutriments et les régimes d’élevage L3. Les quantités en grammes pour chacun des ingrédients nécessaires à la préparation de 1 L d’aliment sont indiquées à la figure 1B.REMARQUE : Tiendront compte du fait qu’environ 13 mL de nourriture sont nécessaires pour remplir une boîte de Pétri de 60 mm. Dissoud…

Representative Results

Les larves de drosophile régulent leur apport en protéines au prix de l’ingestion de glucides en excès23 (diagramme schématique de la figure 2E). En fait, cette priorisation de l’apport en protéines a été observée chez de nombreux autres animaux et s’appelle la protéine tirant partide 24,25. Tirant parti de cette réponse comportementale d’alimentation robu…

Discussion

Avec ce protocole, on pourrait tester la capacité des larves sous activation thermogénétique de populations neuronales spécifiques à réguler les niveaux d’apport en protéines et en glucides, deux macronutriments majeurs, lorsqu’elles sont exposées à des régimes de composition P:C différente. Cette méthode a été testée dans le cadre d’un dépistage préliminaire des larves visant à identifier les populations neuronales associées au contrôle de l’apport alimentaire dans des régimes de qualité ma…

Materials

1.5 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2.0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm petri dishes	Greiner Bio-one, Austria	628161
96 well microplates	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró-vida, Portugal
Bench cooler	Nalgene, USA	Labtop Cooler 5115-0032
Blue food dye	Rayner, Billingshurst, UK
Cell disruption media	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(0.5 mm glass beads)
Dish weight boats	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Embryo collection cage for 60 mm petri dishes	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Featherweight forceps	BioQuip Products, USA	4750
Fly food for stocks maintenance			1 L food contains: 10 g Agar, 100 g Yeast Extract, 50 g Sucrose, 30 mL Nipagin, 3 mL propionic acid
Forceps #5	Dumont	0108-5-PS	Standard tips, INOX, 11cm
Incubator	LMS Ltd, UK	Series 2, Model 230	For thermogenetic feeding assay (30∘C)
Incubator	Percival Scientific, USA	DR36NL	To stage larvae (19∘C)
Janelia lines	Janelia Research Campus		Detailed information in Table 2
Macronutrient balancing diets			Composition and nutritional information in Figure 1
Methanol	VWR	CAS number: 67-56-1
Nipagin (Methyl 4-hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Nitrile gloves	VWR, USA
Refrigerated centrifuge	Eppendorf, Germany	5804 R / Serial number: 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks available at Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 66600	Provided by Carlos Ribeiro Group
Soft brushes			For sorting anaesthetised fruit flies
Spectrophotometer plate reader	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stereo microscope	Nikon	1016625
Sucrose	Sidul, Portugal
Third-instar larvae (L3) rearing diet			Composition and nutritional information in Figure 1
Timer
Tissue lyzer / bead beater	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	Bloomington Drosophila Stock Center	BDSC number: 26264	Expresses TrpA1 under UAS control; may be used to activate neurons experimentally at 25 ∘C
Water bath	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Yeast extract	Pró-vida, Portugal		51% Protein, 15% Carbohydrate