Summary
هنا، ونحن نصف إعداد شرائح القشرة قرن آمون rhinal organotypic. في ظل الحرمان التدريجي والسيطرة عليها من المصل، وهذه الشرائح تصور الأحداث المتطورة مثل الصرع ويمكن اعتبار نموذج الجسم الحي السابق من تكوين الصرع. يمثل هذا النظام أداة ممتازة لرصد ديناميات النشاط التلقائي ، وكذلك لتقييم تطور الميزات العصبية خلال فترة تكوين الصرع.
Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع الثقافات شريحة Organotypic لنموذج اضطرابات الدماغ وتعتبر منصات ممتازة لتقييم الإمكانات العصبية والعلاجية للدواء. يتم إعداد شرائح Organotypic من الأنسجة المقشرة وتمثل بيئة الجسم الحي متعدد الخلايا المعقدة. أنها تحافظ على الخلايا ثلاثية الأبعاد والبيئة المحلية لخلايا الدماغ، والحفاظ على اتصال الخلايا العصبية والتفاعل المتبادل بين الخلايا العصبية وغليا. تعتبر شرائح فرس النهر العضوية مناسبة لاستكشاف الآليات الأساسية لتولد الصرع ، ولكن الأبحاث السريرية والنماذج الحيوانية للصرع تشير إلى أن القشرة الرهينية ، المكونة من القشريات البينة والبينة ، تلعب دورا مناسبا في توليد المضبوطات.
هنا، ونحن نصف إعداد شرائح القشرة قرن آمون rhinal organotypic. وأظهرت تسجيلات النشاط العفوي من منطقة CA3 تحت التشوه مع متوسط النمو الكامل ، في درجة الحرارة الفسيولوجية وفي غياب التلاعب الدوائي ، أن هذه الشرائح تصور الأحداث المتطورة الشبيهة بالصرع على مر الزمن في الثقافة. ولوحظ أيضا زيادة موت الخلايا، من خلال فحص امتصاص يوديد البروبيديوم، وداء الدبقي، الذي تم تقييمه بالكيمياء المناعية المقترنة بالفلور. النهج التجريبي المقدم يسلط الضوء على قيمة الثقافات شريحة القشرة قرن آمون rhinal organotypic كمنصة لدراسة ديناميات وتطور الصرع وفحص الأهداف العلاجية المحتملة لهذا علم أمراض الدماغ.
Introduction
يتميز الصرع، وهو واحد من أكثر الاضطرابات العصبية انتشارا في جميع أنحاء العالم، بالحدوث الدوري وغير المتوقع للنشاط العصبي المتزامن والمفرط في الدماغ. على الرغم من الأدوية المضادة للصرع المختلفة (AEDs) المتاحة ، فإن ثلث المرضى الذين يعانون من الصرع يعانون من الانكسار للعلاج1 ويستمرون في تجربة النوبات والتدهور المعرفي. وعلاوة على ذلك، الاعزانات AEDs المتاحة تعوق الإدراك بسبب أعمالهم المعممة نسبيا على نشاط الخلايا العصبية. من الصعب دراسة تكوين الصرع في البشر ، بسبب إصابات الصرع المتعددة وغير المتجانسة ، وفترات كامنة طويلة تستمر من أشهر إلى عقود ، والآثار المضللة للعلاج المضاد للاختلاج بعد النوبة التلقائية الأولى.
أصبح تحديد العوامل العلاجية المحتملة لعلاج الصرع ممكنا بسبب النماذج الحيوانية للصرع: 1) النماذج الوراثية ، التي تستخدم الحيوانات المهيأة وراثيا التي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي ؛ 1) النماذج الوراثية التي تستخدم الحيوانات المهيأة وراثيا والتي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي ؛ 1) النماذج الوراثية التي تستخدمها الحيوانات المهيأة وراثيا والتي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي؛ (2) النماذج الوراثية التي تستخدم العوامل الوراثية التي تحدث فيها التشنجات بشكل تلقائي أو استجابة لتحفيز حسي؛ (2) العوامل الوراثية المحتملة لعلاج الصرع؛ (2) النماذج الوراثية التي تستخدم الحيوانات الم 2) نماذج من المضبوطات الناجمة عن التحفيز الكهربائي؛ و 3) نماذج الدوائية من التعريفي المضبوطات التي تستخدم pilocarpine (ناهض مستقبلات موسكارينيك), كاينات (ناهض مستقبلات كاينات) أو 4-aminopyridine (مانع قناة البوتاسيوم), من بين أمور أخرى. وكانت هذه النماذج حاسمة في فهم التغيرات السلوكية، فضلا عن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الصرع، وأنها أدت إلى اكتشاف العديد من الأمراض غير المشعةبالكهرباء 2.
الاستعدادات الجسم الحي السابق هي أيضا أداة قوية لاستكشاف الآليات الكامنة وراء الصرع وeptogenesis. شرائح فرس النهر الحادة، والتي تمكن الدراسات الكهربية للخلايا الحية على مدى فترة 6-12 ساعة، وشرائح فرس النهر organotypic التي يمكن الحفاظ عليها في حاضنة على مدى أيام أو أسابيع وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسات نشاط الصرع3.
يتم إعداد شرائح الدماغ Organotypic من الأنسجة المقشرة وتمثل نموذجا فسيولوجيا ثلاثي الأبعاد للدماغ. هذه الشرائح الحفاظ على الخلايا في المنطقة ذات الاهتمام وتشمل جميع خلايا المخ والاتصال بين الخلايا4. المنطقة الأكثر استخداما للثقافات العضوية على المدى الطويل هو قرن آمون، كما تتأثر هذه المنطقة من فقدان الخلايا العصبية في ظروف عصبية متعددة. وقد استخدمت على نطاق واسع لنموذج اضطرابات الدماغ وتعتبر أدوات ممتازة لتقييم الإمكانات العصبية والعلاجية للدواء5,6. ووصفت نماذج من الصرع والسكتة الدماغية والسمية الناجمة عن Aβ في شرائح فرس النهر organotypic7,8,9,10. تم استكشاف مرض باركنسون في ميسنسيفالون البطني والم المخطط، فضلا عن القشرة الجسم كالوسوم المخطط substantia nigra، شرائح organotypic11. Organotypic شريحة المخيخ الثقافات تحاكي العديد من جوانب المايلين محورا ووظائف المخيخ ونموذجا واسع الانتشار للتحقيق في استراتيجيات علاجية جديدة في التصلب المتعدد12.
ومع ذلك، أشارت الأبحاث السريرية والنماذج الحيوانية للصرع إلى أن القشرة الرهينية، التي تتألف من القشريات الهينة والهوينية، تلعب دورا في توليدالمضبوطات 13. وهكذا، تم تأسيس نموذج لتولد الصرع في شرائح الفص الحصين قرن آمون14. في ظل الحرمان التدريجي والتحكم فيه من المصل، تصور شرائح القشرة الحصين العضية المتطورة الأحداث الشبيهة بالصرع، على عكس الشرائح المماثلة التي يتم الاحتفاظ بها دائما في وسط يحتوي على المصل.
في الصرع ، كما هو الحال في العديد من الأمراض الحادة والمزمنة في الجهاز العصبي المركزي ، تفشل الرؤية العصبية المركز في توضيح الآليات الكامنة وراء ظهور المرض وتطوره. تشير الأدلة السريرية والتجريبية إلى التهاب الدماغ ، حيث تلعب الخلايا الدقيقة والخلايا الفلكية دورا مهما ، كواحدة من اللاعبين الرئيسيين الذين يساهمون في عملية الصرع. تشير التجارب الدوائية في النماذج الحيوانية للصرع إلى أنه يمكن تحقيق الآثار المضادة للصرع من خلال استهداف المسارات المؤيدة للالتهابات ، وفي الوقت الحاضر يعتبر الاشتعال العصبي خيارا جديدا لتطوير النهج العلاجية للصرع15.
هنا، ونحن نصف بدقة إعداد الثقافات شريحة عضوية القشرة قرن آمون rhinal، فضلا عن تفاصيل لتسجيل نشاط الصرع العفوية منها. ونحن نسلط الضوء على أن هذا النظام يحاكي العديد من الجوانب العصبية الدموية للصرع، كونها مناسبة بالتالي لاستكشاف دور الخلايا الدبقية والاشتعال العصبي في هذا المرض. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل منصة سهلة الاستخدام لفحص النهج العلاجية المحتملة للصرع.
Protocol
10- وقد احترم القانون البرتغالي والمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي (2010/63/EU) في جميع الإجراءات المتعلقة بحماية الحيوانات للأغراض العلمية. تمت الموافقة على جميع الأساليب المذكورة هنا من قبل الهيئة المؤسسية لرعاية الحيوان التابعة ل iMM (ORBEA-iMM) والسلطة الوطنية المختصة (DGAV - Direção Geral de Alimentação e Veterinária).
1. إعداد شرائح قشرة قرن آمون rhinal
ملاحظة: إعداد شرائح قشرة قرن آمون rhinal يستخدم P6-7 فئران سبراغ دولي.
- إعداد الثقافة والإعداد المتوسط
- في اليوم السابق للثقافة، قم بإعداد الوسائط المطلوبة ووضعها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- إعداد وسيطة تشريح: 25 mM الجلوكوز في محلول الملح المتوازن جي (GBSS).
- إعداد الثقافة المتوسطة: 50٪ Opti-MEM، 25٪ HBSS، 25٪ مصل الحصان (HS)، 25 mM الجلوكوز، 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين.
- إعداد وسائل الصيانة: Neurobasal-A (NBA)، 2٪ B27، 1 mM L-الجلوتامين، 30 ميكروغرام / مل جنتامايسين، HS (15٪، 10٪، 5٪ و 0٪).
- حصاد الدماغ
- قبل البدء بالثقافة، أضف 1.1 مل من الثقافة المتوسطة إلى كل بئر من 6-جيدا مع ماصة P1000 وضعه في 37 درجة مئوية.
- ضع جميع المعدات (مجهر تشريح ، مروحية الأنسجة ، مصباح تشريح ، أدوات تشريح ، أقطاب كهربائية ، لوحات ، إدراج وأوراق تصفية) داخل خزانة السلامة البيولوجية وتعقيمها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
- ضبط سمك شريحة إلى 350 ميكرومتر.
- سحب GBSS من الثلاجة. أضف 5 مل من GBSS إلى ستة أطباق بيتري. ستة أطباق بيتري ستكون مطلوبة لكل.
- قتل جرو الفئران. إجراء قطع الرأس باستخدام مقص حاد في قاعدة جذع الدماغ للحيوان.
- غسل رأس الحيوان ثلاث مرات في GBSS الباردة وأخذه داخل خزانة السلامة.
- عزل الأنسجة وإعداد شرائح
- إدراج ملقط حادة بحزم في مآخذ العين لعقد الرأس.
- باستخدام مقص رقيقة قطع الجلد / فروة الرأس على طول خط الوسط بدءا من الفوامل الفقرية نحو الفصوص الأمامية ووضعها جانبا.
- قطع بنفس الطريقة الجمجمة وعلى طول الشق العرضي الدماغي (المسافة بين الدماغ والمخيخ). مع ملقط طويل منحني، تحريكه بعيدا.
- تجاهل المصابيح الشمية مع ملعقة. إزالة الدماغ من الرأس ووضعه في GBSS الجليد الباردة مع سطح الظهر تواجه(الشكل 1A).
- إدراج ملقط غرامة في المخيخ وتذهب على طول خط الوسط مع ملعقة فتح كل نصف الكرة الأرضية بعناية فائقة(الشكل 1B).
- مع ملقط منحنى قصيرة، وإزالة بعناية الأنسجة الزائدة التي تغطي فرس النهر، دون لمس هيكل فرس النهر. ثم مع ملعقة، وقطع تحت كل قرن آمون (الشكل 1C).
- التقاط نصف الكرة الأرضية واحد ووضعه، مع قرن آمون التي تواجه، على ورقة تصفية. كرر الإجراء مع نصف الكرة الآخر وضعه بالتوازي مع الأول، في ورقة التصفية. وضع ورقة مرشح على المروحية الأنسجة، مع نصفي الكرة الأرضية عمودي على النصل، وقطع نصفي الكرة الأرضية في شرائح 350 ميكرومتر(الشكل 1D).
- وضع الأنسجة شرائح في طبق بيتري مع GBSS الباردة (الشكل 1E).
- فصل بعناية شرائح باستخدام أقطاب طرف الجولة (الشكل 1F). احتفظ فقط بالشرائح ذات القشرة الرهينية السليمة هيكليا والحصين. وينبغي تحديد مناطق DG وCA تماما، وكذلك قشرة الأنف والهين(الشكل 1G).
- ضع كل شريحة على الإدراج(الشكل 1H-I)،مع ملعقة وقطب طرف مستدير. إزالة المتوسطة تشريح الزائدة حول كل شريحة مع ماصة P20 (الشكل 1J). يمكن استزراع أربع شرائح من قشرة قرن آمون في إدراج واحد (الشكل 1K).
- صيانة الثقافة
- تغيير المتوسطة كل يومين.
- الاحماء المتوسطة في 37 °C.
- خذ اللوحات من الحاضنة التقاط كل إدراج عن طريق عقد حافة البلاستيك مع ملقط (الشكل 1L).
- استخدام اليد الحرة لتنشق المتوسطة من البئر. ضع إدراج مرة أخرى في البئر وإضافة 1 مل، مع ماصة P1000، من المتوسطة الدافئة الطازجة(الشكل 1M). كرر لجميع إدراج. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء المحاصرين بين الغشاء والمتوسط.
ملاحظة: شرائح تشبه الصرع تخضع لحرمان تدريجي وخاضع للرقابة من المصل في الوسط. من 9 أيام في المختبر (DIV) على، يتم الحفاظ على شرائح في الدوري الاميركي للمحترفين دون HS14.
الشكل 1: إجراء مفصل لإعداد شرائح الفص القشرة قرن آمون العضية. (أ) إزالة الدماغ من الرأس ووضعه في GBSS الجليد الباردة مع سطح الظهر تواجه. (ب) إدراج ملقط في المخيخ. فتح الدماغ من خلال خط الوسط وإزالة الأنسجة الزائدة على قرن آمون. (ج) مع ملعقة قطع تحت قرن آمون، كما هو مبين من قبل السهام. (د) ضع كلا فرس النهر تواجه وتوازي بعضها البعض على ورقة تصفية وقطع شرائح 350 ميكرومتر على المروحية الأنسجة. (E) وضع قرن آمون شرائح في GBSS الجليد الباردة. (F) فصل شرائح بمساعدة جولة يميل أقطاب الزجاج. (G) اختر فقط الشرائح التي تصور قشرة rhinal سليمة والحصين. (H, I) مع مساعدة من قطب زجاجي جولة يميل دفع كل شريحة إلى ملعقة ووضعها على إدراج. (J) إزالة GBSS المحيطة الشريحة. (K) ضع أربع شرائح لكل إدراج. (L) لتغيير الوسط، ارفع الإدخال و أسبيرتيت الوسط بماصة زجاجية. (M) إضافة وسط جديد عن طريق وضع ماصة بين إدراج وجدران لوحة 6-الآبار. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء تحت شرائح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
2. التسجيلات الكهربية
ملاحظة: تم إجراء التسجيلات الكهربية في شرائح عضوية القشرة قرن آمون في 7 و 14 و 21 DIV في غرفة من نوع واجهة. تم الحصول على التسجيلات مع مكبر للصوت، ورقمنة وتحليلها مع البرمجيات. تمت تصفية جميع التسجيلات (مرشح Bessel ذو القطب الثامن عند 60 هرتز ومرشح Gaussian بسرعة 600 هرتز).
- إعداد الإعداد
- إعداد 50 مل من الدوري الاميركي للمحترفين المتوسطة مع 1 مل من B27 و 250 ميكرولتر من L-الجلوتامين. الاحماء عند 37 °C.
- تعيين الإعداد الفيزيولوجيا الكهربية في دائرة قريبة. تحقق مما إذا كان معدل التدفق 2 مل/دقيقة.
- افتح صندوق السيارة (5٪ CO2/95٪ O2)وافحص مستوى الماء في النظام.
- وضع ورقة تصفية في غرفة تسجيل واجهة لاستنزاف المتوسطة الزائدة وورق تنظيف العدسة تحت الإطار لتوفير المتوسطة إلى الشريحة.
- قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة الحرارة ومكبرات الصوت والميكرومانيبولاتور.
- دع درجة الحرارة في غرفة الواجهة تستقر عند 37 درجة مئوية قبل بدء التسجيلات.
- إعداد السائل النخاعي الاصطناعي (aCSF: 124 mM NaCl، 3m KCl، 1.2 mM NaH2PO4، 25 mM NaHCO3، 10 mM الجلوكوز ، 2 mM CaCl2، 1 mM MgSO4 مع pH 7.4) واستخدامه لملء القطب الزجاجي بحقنة. ضعه في القطب المستقبل.
- تسجيلات النشاط العفوي
- بمجرد استقرار درجة الحرارة، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وقطع شريحة واحدة من الإدراج بشفرة حادة للغاية. وضعه في لوحة 60 ملم مع قطرة من المتوسط. خذه إلى غرفة تسجيل الواجهة.
- ضع الشريحة في غرفة الواجهة مع قرن آمون إلى أسفل اليمين. ضع القطب المستقبل في طبقة الخلية الهرمية CA3.
- انتقل إلى بروتوكول الاستحواذ المستمر وسجل لمدة 30 دقيقة.
3. PI امتصاص المقايسة
ملاحظة: تم تقييم موت الخلية من خلال مراقبة امتصاص الخلوية من الفلورسنت صبغة البروبيديوم يوديد (PI). PI هو مركب قطبي ، يدخل الخلايا ذات أغشية الخلايا التالفة ويتفاعل مع الحمض النووي المنبعث من الفلورسينس الأحمر (امتصاص 493 نانومتر ، انبعاث 630 نانومتر). وبما أن PI ليس من حيث الخلايا الحية ، فإنه يستخدم للكشف عن الخلايا الميتة في السكان.
- حضانة PI
- إعداد، في الثقافة المتوسطة، وتخفيف جديدة 1:10 من الأسهم PI.
- للحصول على اختبار امتصاص PI قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ورفع الإدخال بعناية. إضافة 13 ميكرولتر من PI إلى الوسط، مع ماصة P20، والحصول على تركيز النهائي من 2 ميكرومتر. هياج ببطء لوحة قبل وضع إدراج مرة أخرى في مكانها. تأكد من عدم وجود فقاعات تحت الشرائح.
- وضع شرائح مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- المضي قدما في بروتوكول الكيمياء المناعية، كما هو موضح في القسم التالي. تغطية لوحات مع الألومنيوم، منذ PI حساسة للضوء.
4. الكيمياء المناعية
ملاحظة: في الكيمياء المناعية تم استخدام جسم مضاد محدد للخلايا العصبية ، وكذلك أجسام مضادة قادرة على التمييز بين الأنماط الظاهرية للخلايا المجهرية والخلايا الفلكية التفاعلية ، لتقييم امتداد موت الخلايا العصبية والتلألحم في شرائح الصرع الشبيهة بالقشرة الهينالية.
- تثبيت الأنسجة
- إزالة لوحة من الحاضنة وتوبيخ المتوسطة. إصلاح شرائح مع 4٪ paraformaldehyde (PFA) لمدة 1 ساعة في RT، عن طريق إضافة 1 مل من PFA تحت وفوق شرائح، مع ماصة P1000.
- إزالة PFA وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة أيضا برنامج تلفزيوني تحت وفوق شرائح.
- الحفاظ على شرائح في 4 درجة مئوية، في برنامج تلفزيوني، حتى مزيد من الاستخدام. دائما وضع parafilm حول لوحات لتجنب التجفيف.
- خطوات التثبيط المناعي
- غسل مرتين، 10 دقيقة في كل مرة، مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
- إعداد permeabilization / حظر الحل الذي يحتوي على 1 ٪ تريتون - X100 ، 10 ٪ HS و 10 ٪ BSA في برنامج تلفزيوني. إعداد حل 5٪ BSA.
- رسم مستطيلين مع القلم الكاره للماء(الشكل 2A). قطع شرائح من إدراج (الشكل 2B) مع شفرة حادة للغاية. وضع شريحتين لكل شريحة (الشكل 2C) وإضافة 140 ميكرولتر من permeabilization / حظر الحل على الجزء العلوي من كل شريحة، وذلك باستخدام ماصة P200. حضانة لمدة 3 ساعة في RT.
- تمييع الأجسام المضادة الأولية لتخفيف العمل في 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 °C.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لمدة 4 ساعة في RT. من هذه الخطوة فصاعدا، وحماية لوحة من الضوء منذ يتم العمل مع الفلوروفوريس.
- ضع قطرة 50 ميكرولتر من محلول Hoechst على الجزء العلوي من كل شريحة واحتضنها لمدة 20 دقيقة في RT.
- اغسل بين الحضانات. غسل دائما ثلاث مرات، لمدة 10 دقيقة في كل مرة، مع برنامج تلفزيوني-T.
- إزالة Hoechst وغسل على النحو الموصى به.
- إضافة 50 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على الجزء العلوي من كل شريحة. تغطية مع غطاء الزجاج وتحيط مع طلاء الأظافر (الشكل 2D).
- دعه يجف في RT لمدة 24 ساعة.
- تصور التلطخ المناعي تحت المجهر الكونفوجكال. إبقاء شرائح ملطخة في -20 درجة مئوية.
الشكل 2: إجراء محدد لإجراء فحص الكيمياء المناعية. (أ) مع القلم الكاره للماء رسم مربعين في الشريحة. (ب) قطع قطعة من إدراج التي تحتوي على شريحة. (ج) ضع كل شريحة في المربعات المرسومة بالقلم الكاره للماء وابدأ خطوة permeabilization/blocking. (د) بعد الانتهاء من البروتوكول، والانتهاء من تركيب شرائح في تركيب المتوسطة، وتغطي مع غطاء الزجاج والمحيطة بها مع طلاء الأظافر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Representative Results
استنادا إلى الأوصاف السابقة لتحليل إشارة الصرع في شرائح فرس النهر العضوية ، يتم تعريف التصريفات الصرعية بين الصرع هنا على أنها إفرازات باروكسيسمال التي تتميز بوضوح عن نشاط الخلفية ، مع تغير مفاجئ في القطبية ويحدث بتردد منخفض (<2 هرتز). تتميز التصريفات الباروكسيسمال التي تدوم أكثر من 10 ثانية و تحدث بتردد أعلى (≥2 هرتز) بأنها نشاط الصرع ال ictal. وإذا حدث حادث من أحداث تكنولوجيا المعلومات والاتصالات في غضون 10 ق بعد الحدث السابق، فإن هذين الحدثين يعتبران حدثا واحدا فقط من أحداث تكنولوجيا المعلومات والاتصالات.
شرائح راينال القشرة الحصين organotypic في 7 DIV (الشكل 3A) تصور مختلطة بين الأسنان والنشاط مثل ictal. في 14 DIV (الشكل 3B)، يتميز النشاط التلقائي بتصريفات ictal ، والتي تتطور إلى نشاط ictal ساحق في 21 DIV ، مع أحداث ictal تستمر >1 دقيقة (الشكل 3C).
الشكل 3: نشاط الصرع التلقائي لشرائح القشرة النهرية الحصين العضية. أحداث تمثيلية تشبه الضبط الكهربائي ، تم تسجيلها من منطقة CA3 في غرفة من نوع الواجهة ، بعد (A) 7 DIV ، (B) 14 DIV و (C) 21 DIV. تظهر تفاصيل الضبط في آثار أقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
PI امتصاص المقايسة تليها الكيمياء المناعية ضد علامة الخلايا العصبية NeuN تهدف إلى تحديد موت الخلايا العصبية. ولوحظ امتصاص PI من قبل الخلايا العصبية الحبيبية والهرمية في 7 شرائح DIV (السهام في الشكل 4A)،ولكن عدد الخلايا العصبية PI+ زاد في 14 DIV (السهام في الشكل 4B)،مما يؤكد زيادة موت الخلايا العصبية مع تطور الصرع.
الشكل 4: صور تمثيلية من NeuN وPI الملون قشرة راينال-قرن آمون شرائح organotypic. تم الحصول على صور الخلايا العصبية الناضجة الملون نيون والخلايا الإيجابية PI في (A) 7 DIV و (B) 14 DIV ، على مجهر ليزر confocal مع هدف 20x. يتم عرض الصور المكبرة للمناطق المتقطعة. الأسهم تشير إلى الخلايا العصبية الموت (باللون البرتقالي). شريط مقياس، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تم استخدام تلطيخ مزدوج من Iba1 ، جنبا إلى جنب مع CD68 ، لتقييم النمط الظاهري microglia. Iba1 هو علامة microglia / الضامة ، في حين CD68 هو بروتين الليسوسومات التي أعرب عنها في مستويات عالية من قبل microglia التفاعلية وفي مستويات منخفضة عن طريق الراحة microglia. في 7 شرائح DIV، microglia ramified مع تعبير CD68 منخفضة (الأسهم في الشكل 5A) هي أكثر وفرة من Iba1+/ CD68+ ميكروجليا التفاعلية (رؤوس الأسهم في الشكل 5A)،في حين في 14 DIV، في جميع مناطق قرن آمون، Iba1+/ CD68+ بوشي / الأميبويد M1 microglia (رؤوس الأسهم في الشكل 5B) تتجاوز microglia مع تعبير CD68 منخفضة (الأسهم في الشكل 5B). في 14 DIV بعض Iba1+/ CD68+ يمكن تحديد الخلايا ذات المظهر المفرط (رؤوس الأسهم المفتوحة في الشكل 5B)، مما قد يشير إلى حدوث النمط الظاهري المضاد للالتهابات M2 من microglia. ومع ذلك، تتطلب هذه المسألة مزيدا من الدراسة.
أظهرت الدراسات الحديثة أن مختلف الإصابات CNS بدء يمكن أن تثير ما لا يقل عن نوعين من الخلايا الفلكية التفاعلية, A1 و A2, مع A1 الخلايا الفلكية كونها عصبية16. يتميز النوع الفرعي A1 من الخلايا الفلكية بزيادة التعبير عن تكملة C316،17،18. تكملة C3، الذي يلعب دورا مركزيا في تفعيل نظام تكملة، يولد C3B، الذي هو مزيد من المتدهورة إلى iC3b، C3dg و C3D19. وهكذا، تم استخدام تلطيخ مزدوج من GFAP و C3D لتقييم astrogliosis. في 7 DIV التعبير عن C3D بالكاد يمكن الكشف عنها (الشكل 6A)، بينما في 14 DIV شرائح فرط الترواف GFAP+/ C3d+ يمكن ملاحظة الخلايا الفلكية (رؤوس الأسهم في الشكل 6B)،مما يشير إلى تفعيل التدريجي للخلايا الفلكية A1.
تظهر النتائج تنشيطا تدريجيا للخلايا الدقيقة والخلايا الفلكية طوال فترة تكوين الصرع ، مما يحاكي الأحداث الموصوفة في المرضى الذين يعانون من الصرع وفي النماذج الحيوانية لهذا المرض.
الشكل 5: صور تمثيلية من Iba1 و CD68 الملون قشرة قرن آمون شرائح organotypic. تم الحصول على صور من Iba1 و CD68 microglia الملون ، والنوى الملون Hoechst ، في (A) 7 DIV و (B) 14 DIV ، على مجهر ليزر كونفوج مع هدف 20x. يتم عرض الصور المكبرة للمناطق المتقطعة. الأسهم تشير إلى Iba1+/ CD68- يستريح microglia، رؤوس الأسهم تشير إلى Iba1+/ CD68+ بوشي / أميبويد microglia ورؤوس الأسهم المفتوحة تكشف Iba1+/ CD68+ microglia فرط راميد. شريط مقياس، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: صور تمثيلية من GFAP و C3d الملون قشرة راينال-قرن آمون شرائح organotypic. تم الحصول على صور من الخلايا الفلكية الملطخة GFAP و C3D ، والنوى الملون Hoechst ، في (A) 7 DIV و (B) 14 DIV ، على مجهر ليزر confocal مع هدف 20x. يتم عرض الصور المكبرة للمناطق المتقطعة. تشير رؤوس الأسهم إلى GFAP+/ C3d+ الخلايا الفلكية A1 التفاعلية (باللون الأصفر). شريط مقياس، 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
كانت النماذج الحيوانية للصرع حاسمة لاكتشاف العديد من ال AEDs ، ومع ذلك فهي تتطلب العديد من الحيوانات ومعظمها يستغرق وقتا طويلا بسبب الفترة الكامنة لظهور النوبة. كما تم تنقيح تحريض المغنيسيوم المنخفض للنشاط الصرع في شرائح فرس النهر الحادة بدقة في الأدب3، ولكن الشرائح الحادة لها صلاحية 6-12 ساعة مما يجعل من المستحيل تقييم التغيرات على المدى الطويل. يمكن الحفاظ على شرائح Organotypic في الثقافة من أيام إلى أسابيع ، مما يسمح للتغلب على وقت البقاء القصير للشرائح الحادة ، وقد تم اقتراح نماذج من تكوين الصرع في شرائح فرس النهرالعضوية 3و7و8.
هنا نصف إعداد شرائح organotypic، التي تتألف من قشرة rhinal والحصين. هذه الشرائح تأخذ 15-20 دقيقة لإعداد لكل حيوان، بدءا من التضحية الحيوانية حتى وضع شرائح على إدراج، ويمكن الحصول على 6-8 شرائح في نصف الكرة الأرضية. يجب توخي المزيد من الحذر عند فتح نصف الكرة الأرضية لكشف قرن آمون وعند إزالة الأنسجة من ورقة التصفية بعد تشريحها. الأنسجة الزائدة فوق قرن آمون يمكن أن يعرض للخطر أيضا سلامة شريحة أثناء تشريح.
تصور شرائح الفص الوريدي الحصين العضوي نشاطا متطورا يشبه الصرع يشبه الصرع الحي. بعد أسبوع واحد في الثقافة، تصور معظم الشرائح نشاطا مختلطا بين المجاميع والاتصالات، والذي يتقدم إلى أحداث تشبه تكنولوجيا المعلومات والاتصالات فقط مع مرور الوقت في الثقافة. حتى الآن، لقد سجلنا عدد قليل من التفريغ بين الجثث في شرائح مع 2-3 أسابيع. في هذا النظام، يبدو أن النشاط الشبيه بالصرع يتطور بشكل أسرع مما هو عليه في شرائح فرس النهر العضوية. ويمكن أن يعزى هذا إلى وجود قشرة الرهين، الذي يحافظ على معظم المدخلات الوظيفية إلى قرن آمون. ولمعالجة هذه المسألة معالجة كاملة، يجري حاليا إجراء توصيف كامل للإشارات الصرعية التي تظهرها هذه الشرائح على مدى الزمن في الثقافة، مثل عدد ومدة الأحداث ال ictal، إلى جانب اتساعها وتواترها.
يمكن الحفاظ على هذا النظام في الثقافة لأكثر من ثلاثة أسابيع ، ويحاكي العديد من الارتباطات الجزيئية للصرع ، مثل موت الخلايا العصبية ، وتفعيل microglia والخلايا الفلكية وزيادة إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات14، مما يسمح بتحديد خصائص طويلة الأجل لهذه الجوانب. كما أنه يمثل منصة فحص سهلة الاستخدام، حيث يمكن تنفيذ التدخلات الدوائية التي تستهدف مسارات خلوية محددة ويمكن اختبار الأهداف العلاجية المحتملة. مما لا شك فيه أن النظام المعروض هنا يمكن أن يساعد على زيادة تنوير آليات تكوين الصرع.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يعترفوا بوحدة التصوير البيولوجي التابعة لمعهد ميديسينا الجزيئي جواو لوبو أنتونيس، على جميع الاقتراحات المتعلقة باقتناء الصور.
وقد حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق المنح Nº 952455، ومؤسسة الفقرة A Ciênciae Tecnologia (FCT) من خلال مشروع PTDC/MEDFAR/30933/2017، وFaculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. , Elsevier Academic Press. Cambridge. 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices - a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A.
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
