Summary
여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈에서, 이 조각은 진화하는 간질 같이 사건을 묘사하고 간질 발생의 전 생체 권 모형으로 간주될 수 있습니다. 이 시스템은 자발적인 활동의 역학을 모니터링뿐만 아니라 간질 발생 과정을 통해 신경 염증 기능의 진행을 평가하기위한 훌륭한 도구를 나타냅니다.
Abstract
Organotypic 슬라이스 배양은 뇌 질환을 모델링하는 데 널리 사용되어 왔으며 약물의 신경 보호 및 치료 잠재력을 평가하기위한 훌륭한 플랫폼으로 간주됩니다. Organotypic 슬라이스는 이식 된 조직에서 제조되고 복잡한 다세포 전 생체 환경을 나타냅니다. 그(것)들은 3 차원 세포 건축 및 두뇌 세포의 현지 환경을 보존하고, 신경 연결및 신경 신경교 상호 작용을 유지합니다. 해마 조직화 조각은 간질 발생의 기본 메커니즘을 탐구하기에 적합한 것으로 간주되지만 간질의 임상 연구 및 동물 모델은 복경동맥 및 내경 코르티체로 구성된 비랄 피질이 발작 발생에 관련 역할을한다고 제안했습니다.
여기에서, 우리는 라인 피질-해마 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 완전한 성장 매체와 관류 하에서 CA3 영역에서 자발적활동의 기록은 생리적 온도와 약리학적 조작의 부재에서, 이러한 조각이 문화에서 시간 내내 진화 간질 과 같은 이벤트를 묘사 하는 것으로 나타났다. 증식 요오드 섭취 분석및 글리오증을 통해 세포사멸증가, 형광결합 면역히스토케로 평가된 글리오증도 관찰되었다. 제시된 실험적인 접근은 간질 발생의 역학 그리고 진행을 공부하고 이 두뇌 병학을 위한 잠재적인 치료 표적을 검열하기 위하여 플랫폼으로 라인 피질-해마 organotypic 슬라이스 문화의 가치를 강조합니다.
Introduction
간질, 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 신경 장애 중 하나, 뇌에서 동기화 및 과도 한 신경 활동의 주기적이고 예측할 수 없는 발생에 의해 특징입니다. 다양한 항질약물(AEDs)에도 불구하고 간질 환자의 3분의 1은 치료1에 내성이며 발작과 인지 기능 저하를 계속 경험하고 있습니다. 또한, 사용 가능한 AEDs 신경 활동에 그들의 상대적으로 일반화 된 행동으로 인해 인식 방해. 간질 발생은 인간에서 공부하기 어렵다, 때문에 다발성 간질 간질 부상, 수십 년 동안 지속 긴 잠복 기간, 첫 번째 자발적인 발작 후 항 경련제 치료의 오해의 소지가 효과.
간질 치료를 위한 잠재적인 치료제의 식별은 간질의 동물 모델로 인해 가능해졌습니다: 1) 발작이 자발적으로 또는 감각 자극에 반응하여 발생하는 유전적 걸리기 쉬운 동물을 사용하는 유전 적 모델; 2) 전기 자극 유발 발작의 모델; 및 3) 필로카핀 (무스카리닉 수용체 작용제), 카이네이트 (kainate 수용체 작용제) 또는 4-아미노피리딘 (칼륨 채널 차단제)을 사용하는 발작 유도의 약리학적 모델. 이 모형은 간질의 근본적인 분자 및 세포 기계장치 뿐만 아니라 행동 변경의 이해에서 중요했습니다, 그리고 많은 AEDs2의발견으로 이끌어 냈습니다.
Ex vivo 제제는 또한 간질 발생 및 착형성의 근본적인 기계장치를 탐구하는 강력한 도구입니다. 급성 해마 슬라이스는 6-12 시간 동안 살아있는 세포의 전기 생리학적 연구를 가능하게 하고, 며칠 또는 몇 주 동안 인큐베이터에서 보존될 수 있는 organotypic 해마 슬라이스가 간질 활성3의연구에 광범위하게 사용되어 왔다.
Organotypic 뇌 슬라이스는 이식 된 조직에서 제조되며 뇌의 생리적 3 차원 모델을 나타냅니다. 이 조각은 관심 영역의 세포 구조를 보존하고 모든 뇌 세포와 세포 간 통신4를포함한다. 장기 organotypic 배양에 대 한 가장 사용 되는 영역은 해 마, 이 지역은 여러 신경 퇴행 조건에서 신경 손실에 의해 영향을. 그들은 널리 뇌 질환을 모델링 하는 데 사용 되었습니다 및 약물의 신경 보호 및 치료 잠재력을 평가 하기 위한 우수한 도구로 간주 됩니다5,6. 간질 발생, 뇌졸중 및 Aβ 유도 독성의 모델은 해마 조직성 조각7,8,9,10에서기술되었다. 파킨슨 병은 복부 심연전증과 줄무늬뿐만 아니라 피질 -코퍼스 캘로섬 -striatum-substantia nigra, organotypic 슬라이스11에서탐구되었다. Organotypic 소뇌 슬라이스 배양은 축삭 골수화 및 소뇌 기능의 많은 측면을 모방하고 다발성 경화증12에서새로운 치료 전략을 조사하기위한 광범위한 모델이다.
그러나, 간질의 임상 연구 및 동물 모델은 회선 및 내경 피질에 의해 구성된 비랄 피질이 발작 세대13에서역할을 한다는 것을 건의했습니다. 따라서, 비경피질-해마 에서 간질 발생의 모형이 설치되었다14. 혈청의 점진적이고 통제된 박탈하에서, 라인 피질-해마 organotypic 조각은 항상 혈청을 함유하는 매체에 보관되는 유사한 조각과는 달리, 진화하는 간질 과 같은 사건을 묘사합니다.
간질에서, 중추 신경계의 많은 급성 및 만성 질병에서와 같이, 신경 중심비전은 근본적인 질병 개시 및 진행을 기전을 해명하는 데 실패합니다. 임상 및 실험 적 증거는 간질 과정에 기여하는 주요 선수 중 하나로서 미세 글리아와 성상 세포가 관련 역할을하는 뇌 염증을 가리킵니다. 간질의 동물 모델의 약리학 실험은 항 염증 경로를 표적으로 함으로써 항간질 제행성 효과를 달성 할 수 있음을 시사하며, 요즘 신경 염증은 간질 에 대한 치료 접근법의 개발을위한 새로운 옵션으로 간주됩니다15.
여기서는 라인 피질-해마 의 조직화 배양의 준비와 자발적인 간질 활성을 기록하는 세부 사항을 철저히 설명합니다. 우리는 이 시스템이 간질의 몇몇 신경선동적인 양상을 모방한다는 것을 강조합니다, 이렇게 이 병리학에 있는 신경교 세포 및 신경염증의 역할을 탐구하기 위하여 적당하다. 더욱이, 간질에 대한 잠재적치료접근법의 선별을 위한 사용하기 쉬운 플랫폼을 나타낸다.
Protocol
포르투갈 법과 유럽 연합 (EU) 지침 (2010/63/EU) 과학적 목적을 위해 동물의 보호에 관한 모든 절차에서 존중 되었다. 여기에 설명된 모든 방법은 iMM의 기관 동물 복지 기구 (ORBEA-iMM)와 국가 관할 당국 (DGAV – 디렉샤오 게랄 드 알리멘타샤오 e 베테리나리아)에 의해 승인되었습니다.
1. 라인 피질 해마 슬라이스의 준비
참고: 라인 피질-해마 슬라이스의 준비는 P6-7 스프라그-Dawley 쥐를 사용합니다.
- 문화 설정 및 중간 준비
- 문화 전날, 필요한 매체를 준비하고 4°C에 놓습니다.
- 해부 매체 준비: 25 mM 포도당 게이의 균형 잡힌 소금 용액 (GBSS).
- 배양 배지 준비: 50% 옵티-MEM, 25% HBSS, 25% 말 세럼 (HS), 25 mM 포도당, 30 μg/mL 겐타마이신.
- 유지 보수 매체 준비: 신경 병-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-글루타민, 30 μg/mL 겐타마이신, HS (15%, 10%, 5% 및 0%).
- 뇌 수확
- 문화를 시작하기 직전에 P1000 파이펫으로 6웰 플레이트의 각 웰에 1.1 mL의 배양 배지를 추가하고 37°C에 놓습니다.
- 모든 장비(해부 현미경, 티슈 헬기, 해부 램프, 해부 도구, 전극, 플레이트, 인서트 및 필터 용지)를 생물학적 안전 캐비닛 에 배치하고 15 분 동안 UV 빛 아래에서 살균하십시오.
- 슬라이스 두께를 350 μm로 조정합니다.
- 냉장고에서 GBSS를 인출합니다. 6개의 페트리 요리에 GBSS 5mL를 추가합니다. 동물 1인당 6가지 페트리 요리가 필요합니다.
- 쥐 새끼를 안락사. 동물의 뇌 줄기의 기지에서 날카로운 가위를 사용하여 참수 수행.
- 차가운 GBSS에서 동물의 머리를 세 번 씻고 안전 캐비닛 내부에 가져 가라.
- 조직의 격리 및 슬라이스 준비
- 날카로운 집게를 눈 소켓에 단단히 삽입하여 머리를 잡습니다.
- 얇은 가위를 사용하여 척추 포어맨에서 시작하여 전두엽쪽으로 시작하여 중간선을 따라 피부 /두피를 자르고 옆으로 두십시오.
- 같은 방법으로 두개골과 대뇌 횡단 균열을 따라 잘라 (뇌와 소뇌 사이의 공간). 곡선긴 집게로, 그것을 분리합니다.
- 주걱으로 후각 전구를 버리십시오. 머리에서 뇌를 제거하고 등기 표면이 직면 한 얼음 차가운 GBSS에 놓습니다(그림 1A).
- 소뇌에 미세 한 집게를 삽입 하 고 각 반구를 매우 신중 하 게 열고 주걱으로 중간라인을 따라 이동(도 1B).
- 짧은 곡선 포집으로 해마 구조를 건드리지 않고 해마를 덮는 과잉 조직을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 주걱으로 각 해마(그림 1C)아래로잘라냅니다.
- 한 반구를 집어 들고 해마가 위를 향하도록 필터 용지에 놓습니다. 다른 반구와 절차를 반복하고 필터 용지에 첫 번째 와 평행하게 배치합니다. 칼날에 수직으로 반구와 티슈 헬기에 필터 용지를 넣고 반구를 350 μm 슬라이스(그림 1D)로자른다.
- 슬라이스된 티슈를 차가운 GBSS(그림1E)로페트리 접시에 넣습니다.
- 둥근 끝 전극(그림 1F)을사용하여 슬라이스를 조심스럽게 분리합니다. 구조적으로 손상되지 않은 라인 피질과 해마로 슬라이스만 보관하십시오. DG 및 CA 영역은 내측 및 회선 피질(도1G)뿐만아니라 완벽하게 정의되어야 합니다.
- 각 슬라이스를 주걱과 둥근 팁 전극과 함께 삽입물(그림1H-I)에놓습니다. P20 파이펫(그림1J)을통해 각 슬라이스 주위의 과도한 해부 매체를 제거합니다. 4개의 라인 피질-해마 슬라이스는 단일 인서식(도1K)에서배양될 수 있다.
- 문화 유지 보수
- 격일로 매체를 변경합니다.
- 37°C에서 배지를 데우습니다.
- 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 플라스틱 가장자리를 집게(그림1L)로잡고 각 인서트를 선택합니다.
- 무료 핸드를 사용하여 우물에서 매체를 흡인하십시오. 인서트를 다시 우물에 넣고 P1000 파이펫, 신선한 데운매체(그림 1M)로1mL을 추가합니다. 모든 인서트를 반복합니다. 멤브레인과 매체 사이에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인합니다.
참고: 간질과 같은 조각은 매체에서 혈청의 점진적이고 통제된 박탈을 겪습니다. 9일부터 VItro(DIV)에서 HS14없이 NBA에서 슬라이스를 유지합니다.
그림 1: 라인 피질-해마 organotypic 슬라이스의 준비를 위한 상세한 절차. (A)머리에서 뇌를 제거하고 등받이 표면이 직면 한 얼음 차가운 GBSS에 놓습니다. (B)소뇌에 집게를 삽입한다. 중간선을 통해 뇌를 열고 해마 를 통해 과잉 조직을 제거합니다. (C)화살에 의해 표시된 바와 같이 해마 아래 잘라 주걱으로. (D)해마를 서로 위쪽과 평행하게 필터 용지에 놓고 티슈 헬기에 350 μm 슬라이스를 잘라냅니다. (E)얇게 썬 해마를 얼음차가운 GBSS에 놓습니다. (F)둥근 기울어진 유리 전극의 도움으로 슬라이스를 분리합니다. (G)비경부 피질과 해마를 묘사한 슬라이스만 선택하십시오. (H, I) 둥근 기울어진 유리 전극의 도움으로 각 조각을 주걱으로 밀어 삽입에 놓습니다. (J)슬라이스를 둘러싼 GBSS를 제거합니다. (K)인서츠당 4개의 슬라이스를 놓습니다. (L)매체를 변경하려면, 삽입을 들어 올리고 유리 파이펫으로 매체를 흡인한다. (M)6웰 플레이트의 삽입과 벽 사이에 파이펫을 배치하여 신선한 매체를 추가합니다. 슬라이스 아래에 기포가 없는지 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 전기 생리학적 기록
참고: 전기생리학적 기록은 인터페이스 형 챔버에서 7, 14 및 21 DIV에서 라인 피질-해마 조직 슬라이스에서 수행되었다. 기록은 증폭기로 얻어지고, 디지털화되고, 소프트웨어로 분석하였다. 모든 레코딩은 대역 패스 필터링(60Hz의 8극 베셀 필터, 600Hz의 가우시안 필터)이었다.
- 설치 준비
- B27 의 1 mL및 L-글루타민의 250 μL와 NBA 매체의 50 mL을 준비합니다. 37 °C에서 워밍업하십시오.
- 가까운 회로에서 전기 생리학 설정을 설정합니다. 유량이 2mL/분인지 확인합니다.
- 카박스(5% CO2/95%O2)밸브를 열고 시스템의 수위를 확인합니다.
- 필터 용지를 인터페이스 기록 챔버에 넣어 여분의 매체를 배출하고 프레임 아래에 렌즈 클리닝 용지를 넣어 슬라이스에 매체를 공급합니다.
- 온도 컨트롤러, 증폭기 및 미세 조작기를 켭니다.
- 레코딩을 시작하기 전에 인터페이스 챔버의 온도를 37 °C에서 안정화시키십시오.
- 인공 뇌척수액(aCSF: 124mM NaCl, 3mM KCl, 1.2m MM NaH2PO4,25m NaHCO3,10mM 포도당, 2mM CaCl2,1mM MgSO4 pH 7.4)를 준비하고 유리 전극을 패시링으로 채우는 데 사용한다. 수신 전극에 놓습니다.
- 자발적 활동의 기록
- 온도가 안정되면 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 매우 날카로운 블레이드로 인서식에서 한 조각을 잘라냅니다. 중간 크기의 60mm 접시에 놓습니다. 인터페이스 녹음 챔버에 가져 가라.
- 오른쪽 하단에 해마와 인터페이스 챔버에 슬라이스를 배치합니다. 수신 전극을 CA3 피라미드 세포 층에 배치합니다.
- 연속 인수 프로토콜로 진행하여 30분 동안 기록합니다.
3. PI 섭취 분석
참고: 세포 사멸은 형광염염료 공증요오드(PI)의 세포 섭취를 모니터링하여 평가하였다. PI는 손상된 세포막을 가진 세포를 입력하고 적색 형광을 방출하는 DNA와 상호 작용하는 극성 화합물입니다 (흡광력 493 nm, 방출 630 nm). PI는 살아있는 세포에 퍼백지지 않기 때문에, 집단에서 죽은 세포를 검출하는 데 사용됩니다.
- PI 인큐베이션
- 문화 매체에서 PI 재고의 신선한 1:10 희석을 준비하십시오.
- PI 섭취 분석의 경우 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 조심스럽게 삽입을 올립니다. P20 파이펫을 사용하여 13 μL의 PI를 배지에 추가하여 최종 농도2 μM을 얻습니다. 삽입을 제자리에 다시 넣기 전에 접시를 천천히 교반합니다. 슬라이스 아래에 거품이 없는지 확인합니다.
- 슬라이스를 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 다시 넣습니다.
- 다음 단면도에 설명된 바와 같이 면역히토화학 프로토콜을 진행한다. PI가 가볍기 때문에 알루미늄으로 플레이트를 덮습니다.
4. 면역 화학
참고: 면역 조직화학에서 뉴런 특이적 항체뿐만 아니라 미세 글리아와 성상세포의 휴식 및 반응성 표현형을 구별 할 수있는 항체는 라인 피질 - 해마 간질 과 같은 organotypic 슬라이스에서 신경 죽음과 글리오시스의 연장을 평가하는 데 사용되었습니다.
- 조직 고정
- 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 배지를 흡인합니다. P1000 파이펫으로 슬라이스 아래와 조각 위에 1mL의 PFA를 추가하여 RT에서 1 시간 동안 4 % 파라 포름알데히드 (PFA)로 슬라이스를 수정합니다.
- PFA를 제거하고 PBS의 1mL을 추가합니다. 또한 슬라이스 아래와 위에 PBS를 추가합니다.
- 추가 사용까지, PBS에서 4 °C에서 슬라이스를 유지합니다. 항상 건조를 피하기 위해 접시 주위에 파라필름을 넣어.
- 면역 염색 단계
- PBS 1mL로 매번 2회, 10분 씩 씻으시면 됩니다.
- PBS에서 트리톤 X100 1%, HS 10%, BSA 10%를 포함하는 투과/차단 솔루션을 준비합니다. 5% BSA 솔루션을 준비합니다.
- 소수성펜(도 2A)으로두 개의 직사각형을 그립니다. 매우 날카로운 블레이드로 인서츠(도2B)에서슬라이스를 잘라냅니다. 슬라이드당 두 개의슬라이스(그림 2C)를넣고 P200 파이펫을 사용하여 각 슬라이스 의 상단에 140 μL의 퍼미웰화/차단 용액을 추가합니다. RT에서 3시간 동안 배양합니다.
- PBS에서 5% BSA에서 일차 항체를 작업 희석으로 희석시. 4°C에서 하룻밤 사이에 1차 항체와 함께 배양한다.
- RT에서 4h에 대한 이차 항체와 인큐베이션. 이 단계에서형광이 작업되고 있기 때문에 플레이트를 빛으로부터 보호하십시오.
- 각 슬라이스의 상단에 Hoechst 용액의 50 μL 방울을 놓고 RT에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 인큐베이션 사이에서 씻으실 수 있습니다. PBS-T로 매번 10분 간 세 번 씻으시면 됩니다.
- 호흐트스트를 제거하고 권장대로 씻습니다.
- 각 슬라이스의 상단에 50 μL의 마운팅 매체를 추가합니다. 유리 커버 슬립으로 덮고 매니큐어(그림 2D)로서라운드.
- 24 시간 동안 RT에서 건조하십시오.
- 공초점 현미경하에서 면역 염색을 시각화합니다. 스테인드 슬라이스를 -20°C로 유지합니다.
도 2: 면역히스토케 분석에 대한 구체적인 절차. (A)소수성 펜으로 슬라이드에 두 개의 사각형을 그립니다. (B)슬라이스가 포함된 인서트를 잘라냅니다. (C)각 슬라이스를 소수성 펜으로 그려진 사각형에 놓고 투과/차단 단계를 시작합니다. (D)프로토콜을 마친 후, 슬라이스를 장착 매체에 장착하고, 유리 커버슬립으로 덮고 매니큐어로 둘러싸는 것으로 마무리합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
organotypic 해마 슬라이스에서 간질 신호 분석의 이전 설명에 기초하여, 간질 간질 방전은 여기에 명확하게 배경 활동과 구별되는 발록시 방전으로 정의되어, 극성의 급격한 변화와 저주파에서 발생하는 (<2 Hz). 10s 이상 지속되고 더 높은 주파수(≥2Hz)에서 발생하는 발록시말 방전은 ictal 간질 활성으로 특징지어져 있습니다. 이전 이벤트 이후 10s 이내에 ictal 이벤트가 발생하는 경우 이 두 이벤트는 하나의 ictal 이벤트로 간주됩니다.
7DIV(그림3A)에서라인 피질-해마 조직형 슬라이스가 혼합된 간 및 ictal-like 활동을 묘사합니다. 14DIV(그림3B)에서자발적인 활동은 ictal 방전을 특징으로 하며, 21DIV에서 압도적인 ictal 활동으로 진화하며, ict 이벤트는 >1분(그림3C)입니다.
그림 3: 라인 피질-해마 organotypic 슬라이스의 자발적인 간질 활성. 대표적인 전극 발작과 같은 이벤트는, 인터페이스형 챔버에서 CA3 영역에서 기록된후(A)7 DIV,(B)14DIV 및(C)21DIV. 발작 세부 사항은 낮은 흔적으로 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PI 섭취량 분석은 뉴런 죽음을 식별하기위한 신경 마커 NeuN에 대한 면역 조직 화학에 선행. 과립 및 피라미드 뉴런에 의한 PI 섭취량은 7개의 DIV 슬라이스(도 4A의화살표)에서 관찰되었지만, PI+ 뉴런의 수는 14DIV(도 4B의화살표)에서 증가하여 간질 발생 진행으로 증가된 뉴런 사망을 부식시키는 것이다.
그림 4: NeuN 및 PI 염색 된 비강 피질 -해마 organotypic 슬라이스의 대표적인 이미지. NeuN 염색 성숙한 뉴런 및 PI 양성 세포의 이미지는(A)7 DIV 및(B)14 DIV에서 20배 의 목표와 함께 공초점 레이저 현미경으로 획득하였다. 대시 된 영역의 확대 된 이미지가 표시됩니다. 화살표는 (오렌지)에 죽음의 뉴런을 가리킵니다. 스케일 바, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이바1의 이중 염색은 CD68과 함께 마이크로글리아 표현형을 평가하는 데 사용되었습니다. Iba1은 마이크로글리아/대식세포 마커이며, CD68은 반응성 마이크로글리아에 의해 높은 수준으로 표현되고 마이크로글리아를 쉬게 함으로써 낮은 수준으로 표현되는 리소말 단백질입니다. 7 DIV 슬라이스에서, CD68 발현(도 5A의화살표)이 이바1 +/CD68+ 반응성 마이크로글리아(도 5A의화살촉)보다 풍부하지만, 14DIV에서는 해마의 모든 영역에서 이바1+/CD68+부시/아모에이드 M1 마이크로글리아(그림 5B의 화살)가 마이크로글리아(5B)를 초과하는 마이크로글리아(5B)를 초과한다. 14DIV에서 일부 Iba1+/CD68+ 하이퍼 파급 효과를 가진 세포는 마이크로글리아의 M2 항염증 표현형의 발생을 암시할 수 있는 (도 5B의열린 화살촉)을 가리킬 수 있다. 그러나, 이 문제는 추가 연구가 필요합니다.
최근 연구에 따르면 다른 시동 CNS 부상은 반응성 성상세포인 A1및 A2의 적어도 두 가지 유형을 유도할 수 있으며 A1 성상세포는 신경독성16입니다. A1 성상세포의 서브타입은보완 C316,17,18의증가된 발현을 특징으로 한다. 보완 시스템의 활성화에 중심적인 역할을 하는 보완 C3는 C3b를 생성하며, 이는 iC3b, C3dg 및 C3d19로더욱 저하된다. 따라서, GFAP와 C3d의 이중 염색은 점성동맥 글리오증을 평가하기 위하여 채택되었습니다. 7DIV에서 C3d의 발현은 간신히검출(도 6A)이며,14개의 DIV 슬라이스에서 비대성 GFAP +/C3d+ 성상세포가 관찰될 수 있다(도 6B의화살촉), A1 성상세포의 점진적 활성화를 시사한다.
결과는 간질증환자및 이 병리학의 동물 모형에서 기술된 사건을 모방하는 간질 발생의 과정을 통해 microglia 및 성상 세포의 점진적인 활성화를 보여줍니다.
그림 5: Iba1 및 CD68 염색 된 비강 피질 -해마 organotypic 슬라이스의 대표적인 이미지. 이바1 및 CD68 염색 마이크로글리아 및 Hoechst 염색 핵의 이미지는(A)7 DIV 및(B)14 DIV에서 20배 의 객관적인 공초점 레이저 현미경으로 획득하였다. 대시 된 영역의 확대 된 이미지가 표시됩니다. 화살표는 Iba1+/ CD68을 가리킵니다- 휴식 마이크로 글리아, 화살표 머리는 이바1+/ CD68+ 부시 / 아모에보이드 마이크로 글리아와 오픈 화살표 헤드는 이바1+/ CD68+ 하이퍼 ramified 마이크로 글리아를 나타냅니다. 스케일 바, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: GFAP 및 C3d 염색 된 비강 피질 -해마 organotypic 슬라이스의 대표적인 이미지. GFAP 및 C3d 스테인드 성상세포 및 Hoechst 염색 핵의 이미지는(A)7 DIV 및(B)14 DIV에서 20배 의 객관적인 공초점 레이저 현미경으로 획득하였다. 대시 된 영역의 확대 된 이미지가 표시됩니다. 화살표 헤드는 GFAP+/C3d+ 반응성 A1 성상세포 (노란색)를 가리킵니다. 스케일 바, 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
간질의 동물 모델은 많은 AEDs의 발견에 매우 중요했지만 많은 동물이 필요하고 발작 발병을위한 잠복 기간으로 인해 대부분의 동물이 시간이 많이 걸립니다. 해마 급성 슬라이스에서 간질 활성의 저마그네슘 유도도 문헌3에서철저하게 개정되었지만 급성 슬라이스는 6-12h의 생존력을 가지므로 장기적인 변화를 평가하는 것이 불가능합니다. organotypic 슬라이스는 급성 슬라이스의 짧은 생존 시간을 극복 할 수 있도록, 일에서 주에서 문화에서 유지 될 수 있으며, organotypic 해마 슬라이스에서 간질 발생의 모델이 제안되었다3,7,8.
여기서 우리는 라인 피질과 해마를 포함하는 organotypic 조각의 준비를 설명합니다. 이 조각은 동물당 준비하는 데 15-20 분이 걸리며, 동물 희생에서 시작하여 삽입에 슬라이스를 배치할 때까지, 반구 당 6-8 조각을 얻을 수 있습니다. 해마를 노출하기 위해 반구를 열 때와 슬라이스 후 필터 용지에서 조직을 제거 할 때 추가주의를 기울여야합니다. 해마 위의 과잉 조직은 또한 슬라이스 하는 동안 슬라이스 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
라인 피질-해마 organotypic 조각은 생체 간질에서 닮은 진화하는 간질 같이 활동을 묘사합니다. 문화에서 일주일 후, 대부분의 조각은 문화에서 시간이 지남에 따라 전적으로 ictal 같은 이벤트에 진행 혼합 interictal 및 ictal 같은 활동을 묘사. 지금까지, 우리는 2-3 주 와 조각에 몇 가지 간 방전을 기록했다. 이 시스템에서 간질과 같은 활동은 organotypic 해마 조각보다 빠르게 발생하는 것으로 보입니다. 이것은 해마에 기능 입력의 대부분을 보존 하는 라인 피 질의 존재에 기인 할 수 있습니다. 이 문제를 완전히 해결하기 위해, 그들의 진폭 및 주파수와 함께 ictal 이벤트의 수 및 기간과 같은 문화에서 시간 내내 이러한 조각에 의해 표시되는 간질 신호의 완전한 특성화가 현재 수행되고 있습니다.
이 시스템은 3 주 이상 문화에서 유지 될 수 있으며, 간질의 많은 분자 상관 관계를 모방, 신경 죽음과 같은, 마이크로 글리아와 성상 세포의 활성화 및 프로 염증 성 사이토 카인의 증가 생산14,이러한 측면의 장기 특성화를 허용. 또한 특정 세포 경로를 대상으로 한 약리학적 개입이 구현되고 잠재적인 치료 목표를 테스트할 수 있는 사용하기 쉬운 선별 플랫폼을 나타냅니다. 의심 할 여지없이, 본원에 제시 된 시스템은 간질 발생의 메커니즘을 더 계몽하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이미지 취득에 관한 모든 제안에 대한 Instituto 드 메디치나 분자 주앙 로보 안튠스의 바이오 이미징 단위를 인정하고 싶습니다.
이 프로젝트는 보조금 계약 Nº 952455, Fundação 파라 프로젝트 PTDC / MEDFAR / 30933/2017, 그리고 Faculdade 드 메키나 다 유니베르시다데 드 Lversidade de Lisboaa를 통해 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO43- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
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