Karakterisering av intra-brusk transport egenskaper av kationiske peptid bærere

Summary

Denne protokollen bestemmer likevektopptak, dybde av penetrasjon og ikke-likevekt diffusjonshastighet for kationiske peptid bærere i brusk. Karakterisering av transportegenskaper er avgjørende for å sikre en effektiv biologisk respons. Disse metodene kan brukes for å designe en optimalt ladet narkotika bærere for målretting negativt ladet vev.

Abstract

Flere negativt ladede vev i kroppen, som brusk, presenterer en barriere for målrettet legemiddellevering på grunn av deres høye tetthet av negativt ladede aggrekaner og krever derfor forbedrede målrettingsmetoder for å øke deres terapeutiske respons. Fordi brusk har en høy negativ fast ladningstetthet, kan legemidler endres med positivt ladede legemiddelbærere for å dra nytte av elektrostatiske interaksjoner, noe som åpner for forbedret intrabrusk narkotikatransport. Å studere transport av legemiddelbærere er derfor avgjørende for å forutsi effekten av legemidler for å indusere en biologisk respons. Vi viser utformingen av tre eksperimenter som kan kvantifisere likevektsopptaket, dybden av penetrasjon og ikke-likevektsdiffusjonshastighet av kationiske peptidbærere i bruskekplanter. Likevektopptakseksperimenter gir et mål på den løse konsentrasjonen i brusk i forhold til det omkringliggende badet, noe som er nyttig for å forutsi potensialet til en legemiddelbærer for å øke terapeutisk konsentrasjon av legemidler i brusk. Dybde av penetrasjonsstudier ved hjelp av konfokal mikroskopi gir mulighet for visuell representasjon av 1D-solute diffusjon fra overfladisk til dyp sone av brusk, noe som er viktig for å vurdere om solutes når sine matrise- og cellulære målsteder. Ikke-likevektsdiffusjonshastighetsstudier ved hjelp av et spesialdesignet transportkammer gjør det mulig å måle styrken av bindende interaksjoner med vevsmatrisen ved å karakterisere diffusjonshastigheten til fluorescerende merkede solutes over vevet; Dette er gunstig for å designe bærere med optimal bindingsstyrke med brusk. Sammen gir resultatene fra de tre transporteksperimentene en retningslinje for å utforme optimalt belastede legemiddelbærere som drar nytte av svake og reversible ladeinteraksjoner for søknader om legemiddellevering. Disse eksperimentelle metodene kan også brukes til å evaluere transport av narkotika og narkotika-narkotika bærer konjugater. Videre kan disse metodene tilpasses for bruk i målretting mot andre negativt ladede vev som menisk, hornhinnen og glasslegemet humor.

Introduction

Legemiddellevering til negativt ladet vev i kroppen er fortsatt en utfordring på grunn av manglende evne til narkotika å trenge dypt inn i vevet for å nå celle og matrise mål nettsteder¹. Flere av disse vevene består av tettpakkede, negativt ladede aggrekaner som skaper en høy negativ fast ladningstetthet (FCD)² i vevet og fungerer som en barriere for levering av de fleste^{makromolekyler 3,4}. Men med hjelp av positivt ladede legemiddelbærere, kan denne negativt ladede vevsbarrieren faktisk konverteres til et legemiddeldepot via elektrostatiske ladeinteraksjoner for vedvarende legemiddellevering^1,,5,,6,7( figur1).

Figur 1: Ladebasert intrabrusklevering av CPC-er. Intraartikulær injeksjon av CPC-er i kneleddet. Elektrostatiske interaksjoner mellom positivt ladede CPC-er og negativt ladede aggrekanske grupper muliggjør rask og full dybdegjennomtrengning gjennom brusk. Dette tallet er endret fra Vedadghavami et al⁴. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Nylig ble kationiske peptidbærere (CPC) designet med sikte på å skape små kationiske domener som er i stand til å bære større størrelse terapeutiske midler for levering til negativt ladet^{brusk 4}. For effektiv legemiddellevering til brusk for behandling av^{utbredte 8,,9} og degenerative sykdommer som slitasjegikt (OA)¹⁰, er det avgjørende at terapeutiske konsentrasjoner av legemidler trenger dypt inn i vevet, hvor et flertall av bruskcellene (kondrocytter)^{ligger 11}. Selv om det er flere potensielle sykdomsmodifiserende legemidler tilgjengelig, ingen har fått FDA godkjenning fordi disse ikke er i stand til effektivt å målrette^{brusk 12,13}. Derfor er evaluering av transportegenskapene til legemiddelbærere nødvendig for å forutsi effektiviteten av legemidler for å indusere en terapeutisk respons. Her har vi designet tre separate eksperimenter som kan benyttes for å vurdere likevektsopptaket, dybden av penetrasjon og ikke-likevektsdiffusjonshastighet av CPC⁴.

For å sikre at det er en tilstrekkelig legemiddelkonsentrasjon i brusk som kan gi en optimal terapeutisk respons, ble opptakseksperimenter designet for å kvantifisere likevekt CPC konsentrasjon i^{brusk 4}. I denne designen, etter en likevekt mellom brusk og det omkringliggende badet, kan den totale mengden solutgående inne i brusk (enten bundet til matrisen eller gratis) bestemmes ved hjelp av et opptaksforhold. Dette forholdet beregnes ved å normalisere konsentrasjonen av solutes inne i brusk til likevektbadet. I prinsippet ville nøytrale solutes, hvis diffusjon gjennom brusk ikke er assistert av ladeinteraksjoner, ha et opptaksforhold på mindre enn 1. Omvendt viser kationiske solutes, hvis transport er forbedret via elektrostatiske interaksjoner, et opptaksforhold som er større enn 1. Men, som vist med CPC, bruk av en optimal positiv ladning kan resultere i mye høyere opptaksforhold (større enn 300)⁴.

Selv om høy legemiddelkonsentrasjon i brusk er viktig for å oppnå terapeutisk nytte, er det også avgjørende at legemidler sprer seg gjennom bruskens fulle tykkelse. Derfor er studier som viser dybden av penetrasjon nødvendig for å sikre at legemidler når dypt inne i brusk slik at matrisen og cellulære målsteder kan nås, og dermed gi en mer effektiv terapi. Dette eksperimentet ble designet for å vurdere enveis diffusjon av solutes gjennom brusk, simulere diffusjon av narkotika i brusk etter intra-ledd injeksjon in vivo. Fluorescensavbildning ved hjelp av konfokal mikroskopi gjør det mulig å evaluering av dybden av penetrasjon i brusk. Netto partikkelladning spiller en nøkkelrolle i å moderere hvordan dype legemidler kan spre seg gjennom matrisen. En optimal nettoladning basert på et vev FCD er nødvendig for å tillate svake reversible bindende interaksjoner mellom kationiske partikler og anionisk vevmatrise. Dette innebærer at enhver interaksjon er svak nok slik at partikler kan kobles fra matrisen, men reversibel i naturen slik at den kan binde seg til et annet matrisebindende sted dypere i^{vevet 4}. Omvendt kan overdreven positiv nettoladning av en partikkel være skadelig mot diffusjon, da for sterk matrisebinding forhindrer løsrivelse av partikler fra det opprinnelige bindingsstedet i brusksonen. Dette ville resultere i en utilstrekkelig biologisk respons som et flertall av målstedene ligger dypt inne i^{vevet 11}.

For ytterligere å kvantifisere styrken av de bindende interaksjonene, er analyse av narkotikadiffusjonshastigheter gjennom brusk en fordel. Ikke-likevektsdiffusjonsstudier tillater sammenligning av sanntidsdiffusjonshastigheter mellom forskjellige solutes. Som narkotika diffuse gjennom overfladiske, midtre og dype soner av brusk, kan tilstedeværelsen av bindende interaksjoner i stor grad endre diffusjonshastigheten. Når bindende interaksjoner er tilstede mellom legemidler og bruskmatrisen, er det definert som effektiv diffusivitet (D_EFF). I dette tilfellet, når alle bindende steder har blitt okkupert, er diffusjonsraten av legemidler styrt av steady-state diffusjon (D_SS). Sammenligning mellom D_{EFF av} forskjellig solute bestemmer den relative bindende styrken til solutes med matrisen. For en gitt solute, hvis D_EFF og D_{SS er} innenfor samme størrelsesorden, innebærer det at det er minimal binding tilstede mellom stoffet og matrisen under diffusjon. Men hvis D_{EFF er} større enn D_SS, finnes det betydelig binding av partikler til matrise.

De utformede eksperimentene tillater individuelt karakterisering av solute transport gjennom brusk, men en helhetlig analyse inkludert alle resultater er nødvendig for å designe en optimalt ladet legemiddelbærer. Den svake og reversible karakteren av ladeinteraksjoner styrer partikkeldiffusjonshastigheten og gir høy likevektsopptak og rask full dybdegjennomtrengning gjennom brusk. Gjennom likevektsopptakseksperimenter bør vi se etter bærere som viser høyt opptak som følge av ladeinteraksjoner som kan verifiseres ved hjelp av ikke-likevektsdiffusjonshastighetsstudier. Disse bindingsinteraksjonene bør imidlertid være svake og reversible i naturen for å tillate full tykkelsesinntrengning av det løse gjennom brusk. En ideell legemiddelbærer ville ha en optimal ladning som muliggjør sterk nok binding for opptak og høye intra-brusk narkotikakonsentrasjoner, men ikke for sterk som å hindre full tykkelse diffusjon⁴. De presenterte eksperimentene vil bistå i designegenskapene for ladebaserte vev rettet mot legemiddelbærere. Disse protokollene ble brukt til å karakterisere CPC transport gjennom brusk⁴, men disse kan også brukes på en rekke narkotika og narkotika bærere gjennom brusk og andre negativt ladet vev.

Protocol

Universitetsgodkjenninger ble innhentet for å gjennomføre eksperimenter med dødt vev. Storfe ledd ble hentet kommersielt fra et slakteri. 1. Brusk explant ekstraksjon Bruk en skalpell (#10 blad), kutt og fjern fett, muskler, leddbånd, sener og alt annet bindevev for å eksponere brusk fra femoropatellar sporet av storfe kneledd. Bruk 3 mm og 6 mm dermal slag, gjør vinkelrett slag inn i brusk for å trekke ut sylindriske plugger. Plasser pluggene umiddelbart i individue…

Representative Results

Etter likevektsabsorpsjon av CPC-er ved brusk, reduseres fluorescensen i badekaret når den løse har blitt påvirket av vevet. Men hvis fluorescensverdien av det endelige badet forblir lik den første, indikerer det at det ikke er noe / minimalt oppslutt opptak. En annen bekreftelse på solute opptak er hvis vevet har synlig endret farge til fargen på fluorescerende fargestoff. Det kvantitative opptaket av solutes i brusk ble bestemt ved hjelp av opptaksforholdet (RU) etter at fluorescensverdiene ble konvert…

Discussion

Metodene og protokollene som er beskrevet her, er signifikante for feltet målrettet legemiddellevering til negativt ladet vev. På grunn av den høye tettheten av negativt ladede aggrekaner tilstede i disse vevene, opprettes det en barriere, og dermed hindrer narkotika i å nå sine cellulære målsteder som ligger dypt inne i matrisen. For å løse denne enestående utfordringen, kan narkotika endres for å innlemme positivt ladede legemiddelbærere som kan forbedre transporthastigheten, opptaket og bindingen av narkot…

Materials

316 Stainless Steel SAE Washer	McMaster-Carr	91950A044	For number 5 screw size, 0.14" ID, 0.312" OD
96-Well Polystyrene Plate	Fisherbrand	12566620	Black
Acrylic Thick Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	For non-equilibrium diffusion and 1-D diffusion transport chamber
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240062	100x
Bovine Cartilage	Research 87	N/A	2-3 weeks old, femoropatellar groove
Bovine Serum Albumin	Fisher BioReagents	BP671-1
CPC+14	LifeTein	LT1524	Custom designed peptide
CPC+20	LifeTein	LT1525	Custom designed peptide
CPC+8	LifeTein	LT1523	Custom designed peptide
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark Professional	34155
Dermal Punch	MedBlades	MB5-1	3, 4 and 6 mm
Economy Plain Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Flat Bottom Cell Culture Plates	Corning Costar	3595	Clear, 96 well
Flexible Wrapping Film	Bemis Parafilm M Laboratory	1337412
Gold Seal Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	6378701	# 1.5, 18×18 mm
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A15	1/2" Diameter
Hammer-Driven Hole Punch	McMaster-Carr	3427A19	3/4" Diameter
Laser	Chroma Technology	AT480/30m	Spectrophotometer Laser Light
Low-Strength Steel Hex Nut	McMaster-Carr	90480A007	6-32 Thread size
LSM 700 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 700
Micro Magnetic Stirring Bars	Bel-Art Spinbar	F37119-0007	7×2 mm
Multipurpose Neoprene Rubber Sheet	McMaster-Carr	1370N12	1/32" Thickness
Non-Fat Dried Bovine Milk	Sigma Aldrich	M7409
Petri Dish	Chemglass Life Sciences	CGN1802145	150 mm diameter
Phosphate-Buffered Saline	Corning	21-040-CMR	1x
Plate Shaker	VWR	89032-088
Protease Inhibitors	Thermo Scientific	A32953
Razor Blades	Fisherbrand	12640
R-Cast Acrylic Thin Gauge Sheet	Reynolds Polymer	N/A	Black transport chamber inserts
RTV Silicone	Loctite	234323	Epoxy, Non-corrosive, clear
Scalpel	TedPella	549-3	#10, #11 blades
Signal Receiver	Chroma Technology	ET515lp	Spectrophotometer Laser Signal Receiver
Snap-Cap Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22363204	1.5 mL
Spatula	TedPella	13508
Synergy H1 Microplate Reader	Biotek	H1M
Zinc-Plated Alloy Steel Socket Head Screw	McMaster-Carr	90128A153	6-32 Thread size, 1" Long