Kombinert forløper isotopisk merking og isobar merking (cPILOT) er en forbedret prøve multipleksing strategi som er i stand til å øke antall prøver som kan analyseres samtidig med tilgjengelige isobariske koder. Inkorporering av en robotplattform har økt eksperimentell gjennomstrømning, reproduserbarhet og kvantitativ nøyaktighet.
Vi har introdusert en høy gjennomstrømning kvantitativ proteomics arbeidsflyt, kombinert forløper isootopisk merking og isobarisk merking (cPILOT) i stand til multipleksing opp til 22 eller 24 prøver med tandem massekoder eller isobar N, N-dimetyl leucin isobaric koder, henholdsvis i et enkelt eksperiment. Denne forbedrede prøven multipleksing reduserer betydelig massespektrometri oppkjøpstider og øker nytten av de dyre kommersielle isobariske reagenser. Den manuelle prosessen med prøvehåndtering og pipetteringstrinn i strategien kan imidlertid være arbeidskrevende, tidkrevende og innføre prøvetap og kvantitative feil. Disse begrensningene kan overvinnes gjennom inkorporering av automatisering. Her overførte vi den manuelle cPILOT-protokollen til en automatisert væskehåndteringsenhet som kan forberede store prøvenumre (f.eks. 96 prøver) parallelt. Samlet sett øker automatiseringen gjennomførbarheten og reproduserbarheten til cPILOT og muliggjør bred bruk av andre forskere med sammenlignbare automatiseringsenheter.
Massespektrometri (MS)-baserte proteomics er et uunnværlig forskningsverktøy for å identifisere sykdomsspesifikke biomarkører, forstå sykdomsprogresjon og skape fører for terapeutisk utvikling. Dette kan oppnås fra en rekke sykdomsrelaterte kliniske prøver som blodserum/plasma, proksimale væsker ogvev 1,2. Proteomics biomarkør oppdagelse og validering har nylig fått betydelig vurdering på grunn av kraften i prøve multiplexing strategier3,4. Eksempelmult multipleksing er en teknikk som muliggjør samtidig sammenligning og kvantifisering av to eller flere prøveforhold innenfor en enkelt MS-injeksjon5,6. Prøve multipleksing oppnås ved barkoding peptider eller proteiner fra flere prøver med kjemiske, enzymatiske, eller metabolske koder og få MS-informasjon fra alle prøver i en enkelt MS eller MS / MS eksperiment. Blant de tilgjengelige isobariske kodene er isobariske merking reagenser (iTRAQ), kommersielle tandem massekoder (TMT), og i huset syntetisert isobar N, N-dimetyl leucin (DiLeu) reagenser med evner opp til 16-plex7 og 21-plex8, henholdsvis.
Kombinert forløper isotopisk merking og isobar merking (cPILOT) er en forbedret prøve multipleksing teknologi. cPILOT kombinerer isotopisk merking av peptid N-termini med lys [−(CH3)2] og tung [−(13C2H3)2] isotoper ved lav pH (∼2,5), som holder lysinrester tilgjengelig for etterfølgende høy pH (8,5) isobar merking ved hjelp av TMT, DiLeu eller iTRAQ merking3,9,10,11,12,13,14. Den doble merkingsordningen for cPILOT-strategien er avbildet i supplerende figur 1 med to prøver ved hjelp av et eksempel peptid. Nøyaktigheten og presisjonen til TMT-basert kvantifisering på MS2-nivå kan kompromitteres på grunn av tilstedeværelsen av forurensende koisoforierte og samtidige fragmenterte ioner som bese som interferenseffekt15. Denne begrensningen i unøyaktige reporterionforhold kan overvinnes ved hjelp av tribrid Orbitrap massespektrometre. Interferenseffekten kan for eksempel overvinnes ved å isolere en topp i et dimetylert par på MS1-nivå i massespektrometeret, utsette den lette eller tunge toppen for MS2-fragmentering i den lineære iionfellen og deretter utsette det mest intense MS2-fragmentet for HCD-MS3 for å oppnå kvantitativ informasjon. For å øke sjansene for å velge peptider uten lysin aminer tilgjengelig for å generere reporter ioner, en selektiv MS3 oppkjøp basert på y-1 fragment kan også brukes og er en tilnærming som kan resultere i en høyere prosentandel av peptider kvantifiserbar med cPILOT9. Kombinasjonen av lett og tung merking øker prøve multipleksing evner av en faktor på 2x til det oppnås med individuelle isobariske koder. Vi har nylig brukt cPILOT til å kombinere opptil 24 prøver i et enkelt eksperiment med DiLeu reagenser16. I tillegg cPILOT har blitt brukt til å studere oksidative post-translasjonellemodifikasjoner 14 inkludert protein nitrasjon17,andre globale proteomer9, og har vist anvendelser på tvers av flere vevsprøver i en Alzheimers sykdom mus modell11.
Robust prøveklargjøring er et kritisk skritt i et cPILOT-eksperiment og kan være tidkrevende, arbeidskrevende og omfattende. Forbedret prøve multipleksing krever omfattende pipettering og dyktige laboratoriepersonell, og det er flere faktorer som kan påvirke reproduserbarheten av eksperimentet. For eksempel er nøye håndtering av prøver nødvendig for å sikre lignende reaksjonstider for alle prøver og for å opprettholde passende buffer pH for lette og tunge dimetylert prøver. Videre kan manuell fremstilling av titalls til hundrevis av prøver introdusere høy eksperimentell feil. Derfor, for å redusere variasjonen i prøveforberedelsen, forbedre kvantitativ nøyaktighet og øke eksperimentell gjennomstrømning, utviklet vi derfor en automatisert cPILOT-arbeidsflyt. Automatisering oppnås ved hjelp av en robotvæskehåndteringsenhet som kan fullføre mange aspekter av arbeidsflyten (figur 1). Prøvepreparat fra proteinkvantifisering til peptidmerking ble utført på en automatisert væskebehandling. Den automatiserte væskebehandlingen er integrert med et positivt trykkapparat (PPA) for bufferutveksling mellom SPE-platene (solidfase), orbital shaker og en varme-/kjøleenhet. Robotplattformen inneholder 28 dekksplasseringer for å romme plater og buffere. Det er to pods med en griper for å overføre platene innenfor dekksplasseringene: et 96-kanals fast volumpipetteringshode (5-1100 μL) og 8-kanals variable volumpromer (1-1000 μL). Robotplattformen styres ved hjelp av en programvare. Brukeren må være profesjonelt opplært før du bruker robotvæskebehandlingen. Den nåværende studien fokuserer på å automatisere den manuelle cPILOT-arbeidsflyten, som kan være arbeidsintensiv for behandling av mer enn 12 prøver i ett enkelt parti. For å øke gjennomstrømningen av cPILOT-tilnærmingen11,overførte vi cPILOT-protokollen til en robotvæskebehandling for å behandle mer enn 10 prøver parallelt. Automatiseringen muliggjør også lignende reaksjoner for hver prøve parallelt under ulike trinn i prøveforberedelsesprosessen, noe som krevde høyt utdannede brukere å oppnå under manuell cPILOT. Denne protokollen fokuserer på implementeringen av den automatiserte væskehåndteringsenheten for å utføre cPILOT. Den nåværende studien beskriver protokollen for bruk av dette automatiserte systemet og demonstrerer ytelsen ved hjelp av en 22-plex “proof-of-concept” analyse av museleverhomogenater.
cPILOT er en forbedret multipleksstrategi som kan analysere opptil 24 prøver i ett enkelt eksperiment. Multipleksingskapasiteten avhenger av antall tilgjengelige isotopiske og isobariske merkingskombinasjoner. Innføring av TMTpro7, som er i stand til å tagge 16 prøver i enkelt eksperiment, kan presse grensene for cPILOT til 32-plex. cPILOT består av flere pipetteringstrinn og krever omfattende pleie- og brukerferdigheter for å utføre prøveklargjøring. Selv med en ekspertbruker er manuelle feil uunngåelige, noe som inviterer til bruk av robotplattformer til å behandle prøver i cPILOT-strategien. Siden cPILOT benytter pH-avhengig merking av peptidene, må pH opprettholdes for lyset og det tunge dimetylertsettet med prøver. Mildt sur-grunnleggende pH kan resultere i dimetylering av både N-termini og lysinrester. En fordel med cPILOT er at det krever bare halvparten av isobariske koder siden peptid N-termini er opptatt med dimetylgrupper. Dette gir et større antall prøver å bli merket til halve prisen. Håndtering av større utvalgsnumre krever at reagenseksponeringstidene er like for den første og den siste prøven i en satsvis. En pipettedispenser som kan romme opptil 32 prøver parallelt, kan best oppnås ved bruk av robotvæskehåndteringsenheter.
For å behandle flere eksempler av cPILOT ble den manuelle arbeidsflyten endret for å innlemme automatisering. Robotvæskehåndteren som brukes i denne studien har to pods med 96-kanals og 8-kanals pipetteringsevner, med en griper for å plassere platene på de tilgjengelige 28 dekksstedene. Væskehåndtereren er integrert med et positivt trykkapparat, orbital shaker og en enhet for å varme/kjøle prøver i 96-brønnplaten. Det positive trykkapparatet bidrar til å utføre bufferutvekslinger i SPE-platene under opprydding, mens orbital shakeren bidrar til å virvle/ blande prøvene. Robotplattformen ble programmert til å aspirere og dispensere buffere og prøver til 96-brønnsplater, inkubere, vortexprøver og overføringsplater. Væsker med forskjellige viskositeter, som acetonitril og vann, krever spesifikke pipetteringshensyn som også kan programmeres inn i metoden.
CPILOT-arbeidsflyten, fra BCA-proteinkvantifisering til merking av peptider med isobariske koder (det vil si TMT), ble utført på væskebehandlingssystemet. Den komplette protokollen ble skalert til å bruke 96 dype brønnplater som kan holde 2 ml per brønn. Bufferne ble forberedt før starten av eksperimentet og lagt til 96 brønnplaten for å tillate parallell prøvebehandling. I den nåværende studien ble 22 arbeidsflyttrans repliker av musleverhomogenat lagt til de dype brønnplatene og tatt gjennom cPILOT-protokollen. Til slutt ble en enkelt prøve bestående av 22-plex equimolar muslevermerket peptider injisert til massespektrometeret. Reporter ion intensiteter tilsvarende peptid overflod i prøvene viste at prøver behandlet med væske handler har lavere CVer enn den manuelle protokollen (data ikke vist). Robotplattformen forbedret også reproduserbarheten ved prøvebehandling. Reproduserbarhet og robusthet er svært viktige faktorer ved behandling av et stort antall prøver. Pipetteringsfeil kan føre til fullstendig feiltolkning av dataene, og her ga robotplattformen lav inter-sample variasjon. Også ved hjelp av robotplattformen for cPILOT reduserte tiden det tar å forberede prøver. For eksempel, etter å ha utviklet den automatiserte metoden, krevde det 2,5 t for å behandle 22 prøver i forhold til 7,5 t for manuell cPILOT. Eksperimenter pågår i laboratoriet vårt for å evaluere sammenligninger av de manuelle og automatiserte cPILOT-arbeidsflytene ytterligere. Basert på tidligere rapporter fra vårt laboratorium, var CV%s av proteinreporterionintensiteter i den manuelle cPILOT i gjennomsnitt 20% med noen outliers som overstiger denne verdien12.
cPILOT er en kjemisk derivatiseringsstrategi på peptidnivå, som kan brukes til enhver prøvetype som celler, vev og kroppsvæsker. cPILOT tilbyr forbedret prøveplumksering, og med inkorporering av automatisering kan det lette multiplummering av prøve multiplekser med høy gjennomstrømning i proteomics. Denne gjennomstrømningen er nødvendig for å fremme sykdom og biologisk forståelse og biomarkøroppdagelse.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner Vanderbilt University Start-up Funds og NIH award (R01GM117191) til RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |