Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förstärkt prov multiplexing strategi som är kapabel att öka antalet prover som kan analyseras samtidigt med tillgängliga isobaric taggar. Införlivandet av en robotplattform har kraftigt ökat experimentell genomströmning, reproducerbarhet och kvantitativ noggrannhet.
Vi har infört en hög genomströmning kvantitativa proteomik arbetsflöde, kombinerade föregångare isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) kan multiplexera upp till 22 eller 24 prover med tandem massa taggar eller isobaric N,N-dimetyl leucin isobaric taggar, respektive, i ett enda experiment. Detta förbättrade prov multiplexing avsevärt minskar massa spektrometri förvärv gånger och ökar nyttan av de dyra kommersiella isobaric reagenser. Den manuella processen för provhantering och pipetteringssteg i strategin kan dock vara arbetsintensiv, tidskrävande och införa provförlust och kvantitativt fel. Dessa begränsningar kan övervinnas genom införlivandet av automatisering. Här överförde vi det manuella cPILOT-protokollet till en automatiserad vätskehanteringsanordning som kan förbereda stora provnummer (dvs. 96 prover) parallellt. Sammantaget ökar automatiseringen genomförbarheten och reproducerbarheten av cPILOT och möjliggör bred användning av andra forskare med jämförbara automationsenheter.
Masspektrometri (MS)-baserade proteomik är ett oumbärligt forskningsverktyg för att identifiera sjukdomsspecifika biomarkörer, förstå sjukdomsprogression, och skapa leads för terapeutisk utveckling. Detta kan uppnås från en rad sjukdomsrelaterade kliniska prover såsom blodserum/plasma, proximala vätskor, och vävnader1,2. Proteomics biomarkör upptäckt och validering har nyligen fått betydande övervägande på grund av kraften i prov multiplexering strategier3,4. Prov multiplexing är en teknik som möjliggör samtidig jämförelse och kvantifiering av två eller flera prov villkor inom en enda MS injektion5,6. Prov multiplexering uppnås genom barcoding peptider eller proteiner från flera prover med kemiska, enzymatiska eller metaboliska taggar och erhålla MS information från alla prover i en enda MS eller MS / MS experiment. Bland de tillgängliga isobaric taggar är isobaric taggning reagenser (iTRAQ), kommersiell tandem massa taggar (TMT), och i huset syntetiserade isobaric N,N-dimetyl leucin (DiLeu) reagenser med kapacitet upp till 16-plex7 och 21-plex8, respektive.
Kombinerad prekursor isotopisk märkning och isobaric märkning (cPILOT) är en förbättrad prov multiplexing teknik. cPILOT kombinerar isotopisk märkning av peptid N-termini med ljus [−(CH3)2] och tung [−(13C2H3)2] isotoper vid lågt pH (∼2,5), som håller lysinresterna tillgängliga för efterföljande högt pH (8,5) isobaricmärkning med hjälp av TMT, DiLeu, eller iTRAQ-märkning3,9,10,11,12,13,14. CPILOT-strategins dubbla märkningsschema avbildas i Supplemental Figure 1 med två prover med hjälp av en exempelpeptid. Noggrannheten och precisionen i den TMT baserade kvantifieringen på MS2-nivån kan äventyras på grund av förekomsten av förorenande samisolade och co-fragmenterade joner som benämns som störningseffekten15. Denna begränsning i felaktiga reporterjonsförhållanden kan övervinnas med hjälp av tribrid Orbitrap masspektrometrar. Till exempel kan interferenseffekten övervinnas genom att isolera en topp i ett dimetylerat par på MS1-nivå i masspektrometern, utsätta den lätta eller tunga toppen för MS2-fragmentering i den linjära jonfällan och sedan utsätta det mest intensiva MS2-fragmentet för HCD-MS3 för att erhålla kvantitativ information. För att öka chanserna att välja peptiderna utan lysinaminer som finns för att generera reporterjoner, kan ett selektivt MS3-förvärv baserat på y-1-fragmentet också användas och är ett tillvägagångssätt som kan resultera i en högre andel peptider som är kvantifierbara med cPILOT9. Kombinationen av lätta och tunga märkning ökar prov multiplexing kapacitet med en faktor 2x till som uppnås med enskilda isobaric taggar. Vi har nyligen använt cPILOT för att kombinera upp till 24 prover i ett enda experiment med DiLeu reagenser16. Dessutom cPILOT har använts för att studera oxidativa post-translationella modifieringar14 inklusive protein nitration17, andra globala proteomer9, och har visat applikationer över flera vävnadsprover i en Alzheimers sjukdom mus modell11.
Robust provberedning är ett kritiskt steg i ett cPILOT-experiment och kan vara tidskrävande, mödosamt och omfattande. Förstärkt provpleducering kräver omfattande pipettering och högkvalificerad laboratoriepersonal, och det finns flera faktorer som starkt kan påverka reproducerbarheten av experimentet. Till exempel är noggrann hantering av prover nödvändig för att säkerställa liknande reaktionstider för alla prover och för att upprätthålla lämpligt buffert pH för lätta och tunga dimetylerade prover. Vidare kan manuell beredning av tiotals till hundratals prover införa hög experimentell fel. Därför, för att minska prov beredning variabilitet, förbättra kvantitativ noggrannhet, och öka experimentella genomströmningen, vi utvecklat en automatiserad cPILOT arbetsflöde. Automatisering uppnås med hjälp av en enhet för hantering av robotteknikvätska som kan slutföra många aspekter av arbetsflödet (Bild 1). Provberedning från proteinkvantifiering till peptidmärkning utfördes på en automatiserad vätskehanterare. Den automatiserade vätskehanteraren är integrerad med en PPA (positive pressure apparatus) för buffertutbyten mellan SPE-plattorna (solid-phase extraction), orbital shaker och en uppvärmnings-/kylanordning. Robotplattformen innehåller 28 däcksplatser för att rymma tallrikar och buffertar. Det finns två pods med en gripare för att överföra plattorna inom däcksplatserna: ett 96-kanals fast volym pipetteringshuvud (5-1100 μL) och 8 kanals variabla volymsonder (1-1000 μL). Robotplattformen styrs med hjälp av en programvara. Användaren måste vara professionellt utbildad innan du använder den robotliknande vätskehanteraren. Den föreliggande studien fokuserar på att automatisera det manuella cPILOT-arbetsflödet, som kan vara arbetskrävande för bearbetning av mer än 12 prover i en enda sats. För att öka genomströmningen avcPILOT-inflygningen 11, överförde vi cPILOT-protokollet till en robotflytande hanterare för att bearbeta mer än 10 prover parallellt. Automatiseringen tillåter också liknande reaktioner för varje prov parallellt under olika steg av provberedningsprocessen, vilket krävde att mycket utbildade användare skulle uppnå under manuell cPILOT. Detta protokoll fokuserar på genomförandet av den automatiserade vätskehanteringsanordningen för att utföra cPILOT. Den föreliggande studien beskriver protokollet för att använda detta automatiserade system och visar dess prestanda med hjälp av en 22-plex “proof-of-concept” analys av muslever homogenates.
cPILOT är en förbättrad multiplexeringsstrategi som kan analysera upp till 24 prover i ett enda experiment. Multiplexeringskapaciteten beror på antalet tillgängliga isotopiska och isobaric taggning kombinationer. Införande av TMTpro7, som kan märka 16 prover i enstaka experiment, kan tänja på gränserna för cPILOT till 32-plex. cPILOT består av flera pipetting steg och kräver omfattande vård och användarkunskaper för att utföra provberedning. Även med en expertanvändare är manuella fel oundvikliga, vilket inbjuder till användning av robotplattformar för att bearbeta prover i cPILOT-strategin. Eftersom cPILOT utnyttjar pH-beroende märkning av peptiderna behöver pH-värdet bibehållas för ljuset och den tunga dimetylerade uppsättningen prover. Milt surt-grundläggande pH-värde kan resultera i dimetylering av både N-termini och lysinrester. En fördel med cPILOT är att det kräver bara hälften av de isobaric taggarna sedan peptid N-termini är upptagna med dimetylgrupperna. Detta ger ett större antal prover som ska märkas till halva kostnaden. Hantering av större provnummer kräver att reagensexponeringstiderna är liknande för det första och det sista provet i en sats. En pipettdispenser som kan rymma upp till 32 prover parallellt kan bäst uppnås med hjälp av anordningar för hantering av robotteknik flytande.
För att kunna bearbeta flera prover genom cPILOT ändrades det manuella arbetsflödet så att det införlivade automatiseringen. Den robotflytande hanterare som används i denna studie har två skida med 96-kanaliga och 8-kanaliga pipetting förmågor, med en gripare för att placera plattorna i de tillgängliga 28 däck platser. Vätskehanteraren är integrerad med en positiv tryckapparat, orbital shaker, och en anordning för att värma / kyla prover i 96 brunnsplattan. Den positiva tryckapparaten hjälper till att utföra buffertutbyten i SPE-plattorna under sanering, medan orbitalskakapparaten hjälper till att virvel/blanda proverna. Robotplattformen programmerades att aspirera och dosera buffertar och prover till 96-brunnsplattor, inkubera, virvelprover och överföringsplattor. Vätskor med olika viskositeter, såsom acetonitril och vatten, kräver specifika pipettering överväganden som också kan programmeras in i metoden.
CPILOT-arbetsflödet, med början från proteinkvantifiering av BCA till att märka peptiderna med isobaric-taggar (dvs. TMT), utfördes på vätskehanterarsystemet. Det kompletta protokollet skalades för att använda 96 djupa brunnsplattor som kan hålla 2 mL per brunn. Buffertarna utarbetades före början av experimentet och lades till 96 brunnsplattan så att parallell provbearbetning tilläts. I den föreliggande studien, 22 arbetsflöde replikat av mus lever homogenate lades till den djupa väl plattor och tas genom cPILOT protokollet. Slutligen, ett enda prov som består av 22-plex equimolar mus levern taggade peptider injicerades till masspektrometern. Reporterjonintensiteter som motsvarar peptidöverflöd i proverna visade att prover som bearbetas med vätskehanteraren har lägre CV än det manuella protokollet (data som inte visas). Robotplattformen förbättrade också i högdet reproducerbarheten av provbearbetning. Reproducerbarhet och robusthet är mycket viktiga faktorer samtidigt som man bearbetar stora antal prover. Pipetting fel kan leda till fullständig felaktig tolkning av data och här robotplattformen som låg inter-prov variation. Även med hjälp av robotplattformen för cPILOT minskade den tid som krävs för att förbereda prover. Till exempel, efter att ha utvecklat den automatiserade metoden, krävs det 2,5 h för att bearbeta 22 prover i jämförelse med 7,5 h för manuell cPILOT. Experiment pågår i vårt laboratorium för att ytterligare utvärdera jämförelser av de manuella och automatiserade cPILOT-arbetsflödena. Baserat på tidigare rapporter från vårt laboratorium, CV% s av protein reporter jonintensiteter i den manuella cPILOT var i genomsnitt 20% med vissa extremvärden överstiger detta värde12.
cPILOT är en kemisk derivatiseringsstrategi på peptidnivå, som kan användas för alla provtyp såsom celler, vävnader och kroppsvätskor. cPILOT erbjuder förbättrad prov-multiplexering och med införlivandet av automatisering kan underlätta prov med hög genomströmning av multiplexering i proteomik. Denna genomströmning är nödvändig för att ytterligare främja sjukdom och biologisk förståelse och biomarkör upptäckt.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Vanderbilt University Start-up Fonder och NIH tilldelning (R01GM117191) till RASR.
0.6 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 04-408-120 | Any brand of 0.6 mL eppendorf tubes are sufficient |
0.65 µm Ultrafree MC DV centrifugal filter units | EMD Millipore | UFC30DV00 | |
1.5 mL eppendorf tubes, 500 pk | Fisher Scientific | 05-408-129 | Any brand of 1.5 mL eppendorf tubes are sufficient |
2 ml black deep well plate | Analytical Sales and Services, Inc. | 59623-23BKGC | Any brand of black 96-well plate is sufficient |
2 ml clear deep well plate | VWR | 75870-796 | |
Acetic Acid | J.T. Baker | 9508-01 | |
Acetonitrile – MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | 4 L quantity is not necessary |
Agilent 500µL plate | Agilent | 203942-100 | Reagent plate for adding buffers |
Ammonium formate | Acros Organics | 208-753-9 | |
Ammonium hydroxide solution (28 – 30%) | Sigma Aldrich | 320145-500ML | |
Analytical balance | Mettler Toledo | AL54 | |
BCA protein assay kit | Pierce Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Biomek i7 hybrid | Beckmann | Any liquid handling device with ability to use positive pressure, heating/cooling and Vortex the samples. | |
C18 packing material (2.5 µm, 100 Å) | Bruker | This item is no longer available from Bruker. Alternative packing material with listed specifications will be sufficient | |
Centrifuge with plate rotor | Thermo Scientific | 69720 | |
Micro 21R Centrifuge | Sorval | 5437 | |
Dionex 3000 UHPLC | Thermo Scientific | This model is no longer available. Any nano LC with an autosampler is sufficient. | |
Dithiothreiotol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
Formaldehyde (13CD2O) solution; 20 wt % in D2O, 98 atom % D, 99 atom % 13C | Sigma Aldrich, Chemistry | 596388-1G | |
Formaldehyde (CH2O) solution; 36.5 – 38% in H2O | Sigma Aldrich, Life Science | F8775-25ML | |
Formic Acid | Fluka Analytical | 94318-250ML-F | |
Fusion Lumos Mass Spectrometer | Thermo Scientific | This model is no longer available. Other high resolution instruments (e.g. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion, or Orbitrap Fusion Lumos) can be used. | |
Hydroxylamine hydrochloride | Sigma Aldrich, Chemistry | 255580-100G | |
Iodoacetamide (IAM) | Acros Organics | 144-48-9 | |
Isobaric Tagging Kit (TMT 11-plex) | Thermo Fisher Scientific | 90061 | |
L-1-tosylamido-2 phenylethyl cholormethyl ketone (TPCK)-treated Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich, Life Science | T1426-100MG | |
L-Cysteine | Sigma Aldrich, Chemistry | 168149-25G | |
Mechanical Homogenizer (i.e. FastPrep-24 5G) | MP Biomedicals | 116005500 | |
pH 10 buffer | Fisher Scientific | 06-664-261 | Any brand of pH buffer 10 is sufficient |
pH 7 buffer | Fisher Scientific | 06-664-260 | Any brand pH buffer 7 is sufficient |
pH meter (Tris compatiable) | Fisher Scientific (Accumet) | 13-620-183 | Any brand of a pH meter is sufficient |
Protein software (e.g. Proteome Discoverer) | Thermo Scientific | ||
Reservior plate 200ml | Agilent | 204017-100 | |
Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98% CP | Sigma Aldrich, Chemistry | 190020-1G | |
Sodium Cyanoborohydride; reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 156159-10G | |
Speed-vac | Thermo Scientific | SPD1010 | any brand of speed vac that can accommodate a deep well plate is sufficient |
Stir plate | VWR | 12365-382 | Any brand of stir plates are sufficient |
Targa 20 mg SPE plates | Nest Group, Inc. | HNS S18V | These are C18 cartridges |
Triethyl ammonium bicarbonate (TEAB) buffer | Sigma Aldrich, Life Science | T7408-100ML | |
Tris | Biorad | 161-0716 | |
Biomek 24-Place Tube Rack Holder | Beckmann | 373661 | |
Urea | Biorad | 161-0731 | |
Water – MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 | 4 L quantity is not necessary |