자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인
Summary
신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.
Abstract
게놈 전체 협회 연구가 많은 신경 질환의 이기종 유전 기초에 빛을 발산으로, 뇌 개발 및 기능에 특정 유전자의 기여를 연구 할 필요가 증가. 생생 마우스 라인이 매우 비용이 많이 들고 많은 새로운 질병 관련 유전자가 아직 상업적으로 이용 가능한 유전 라인을 가지고 있지 않기 때문에 특정 유전 조작의 역할을 연구하기 위하여 마우스 모형에 의지하는 것은 항상 가능하지 않습니다. 또한 마우스 선을 만드는 데 수년간의 개발 및 유효성 검사가 걸릴 수 있습니다. 자궁에서 전기 기공은 특정 유전 적 조작을 달성하기 위해 DNA 플라스미드를 개발해야만 하는 생체 내에서 세포 형 특정 방식으로 유전자 발현을 조작하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공한다. 자궁 전기화의 양자는 전두엽 피질 피라미드 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 유전자 전달 방법과 행동 접근법을 결합하면 전두엽 피질 네트워크의 기능과 청소년 및 성인 마우스의 사회적 행동에 대한 유전 조작의 효과를 연구 할 수 있습니다.
Introduction
게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 뇌 병리1,2,3,4와관련된 새로운 후보 유전자의발견을주도했다. 이러한 연구는 정신 분열증 (SCZ)과 같은 치명적인 신경 정신 장애를 이해하는 데 특히 도움이되었으며, 새로운 유전자의 조사는 새로운 연구 및 치료 개입 라인의 시작 점으로 사용되었습니다5,6. SCZ에 대한 위험을 품고 있는 유전자는 산전 및 조기 산후 발달 중 전두엽 피질(PFC)에서 편향된 발현을 나타내며, 이는 여러 신경정신장애의 병리학에 연루된영역(7)이다. 또한, 정신 장애의 마우스 모델은 PFC 네트워크6,8,9에서비정상적인활성을나타낸다. 이 결과는 SZC 관련 유전자가 이 지역의 발달 배선에 있는 역할을 할 지도 모른다는 것을 건의합니다. 동물 모델을 이용한 추가 조사는 PFC에 있는 연결의 설치에 이 후보 유전자의 기여를 이해하고 이 유전자가 신경 정신병 장애의 병인에 있는 원인 역할이 있는지 결정하기 위하여 요구됩니다. 산전 및 조기 산후 발달 중 특정 뉴런 회로에 대한 유전자 발현 변화를 연구할 수 있는 마우스의 유전자 조작 기술은 유전자 발현 변화를 PFC 기능 장애에 연결하는 분자 메커니즘을 이해하는 유망한 방법이다.
유전 마우스 라인은 뇌 발달과 기능에 특정 유전자의 영향을 연구하는 방법을 제공합니다. 그러나, 형질 전환 쥐에 의존하는 것은 신경 회로 개발에 특정 유전자의 효력을 검토하기 위하여 항상 상업적으로 이용 가능한 라인이 없기 때문에 제한될 수 있습니다. 또한 사용자 지정 마우스 라인을 개발하는 데 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 형질전환 마우스와 바이러스 접근법을 결합한 교차 유전자 조작 전략의 사용은 뇌10,11,12의 이해에 혁명을일으켰습니다. 많은 진보에도 불구하고, 바이러스 전략은 바이러스발현(13)과 바이러스 발현(14)과 관련된 세포 독성을제한할 수 있는 포장 용량의 한계를 포함하여 바이러스 벡터 유형에 따라 일정한 한계를 가지고 있다. 더욱이, 대부분의 실험 조건에서, 아데노 관련 바이러스를 이용한 강력한 유전자 발현(AAV)은 약 2~4주15일이필요하며, 조기 산후 발달 시 유전자를 조작할 수 없는 일상적인 바이러스 전략을 만드는 것이다.
자궁 전기기화(IUE)에서 신속하고 저렴한 유전자 전달을 허용하는 대체 접근법은형광 라벨링 및 약리유전학 적 또는 광유전학적 접근법과 결합될 때, 뉴런 회로의 기능을 해부하는 강력한 플랫폼을 제공한다. 또한, CRISPR-Cas9 게놈 편집 유전자의 발달과 함께 특정 유전자의 세포형 특이적 노크다운 또는 노크아웃을 통해 또는프로모터(18,19)의변조를 통해 과발성 또는 정확하게 변경될 수 있다. IUE를 이용한 유전자 조작 접근법은 유전자가 좁은 발달창(20)동안 시험될 필요가 있을 때 특히 유리하다. IUE는 다목적 기술이며 특정 프로모터 하에서 발현 벡터에 유전자를 삽입하여 쉽게 수행될 수 있다. 유전자 발현의 추가 제어는 상이한 강점의 프로모터를 이용하여 발현을 구동하거나 유전자발현(21,22)을일시적으로 조절할 수 있는 유도성 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 추가적으로, IUE는 특정 피질 층, 세포 모형 및 두뇌 지구 내의 세포의 표적을 허용합니다, 다른 접근을 사용하여 항상 가능하지 는 않습니다5,17. 보다 효율적인 전극 분포를 생성하는 3개의 전극의 사용에 기초한 IUE 구성의 최근 발전은 이 방법의 기능적 레퍼토리를 확대하고 과학자들이 새로운 세포 유형을 표적으로 하고23,24를표적으로 할 수 있는 세포의 효율, 정확성 및 수를 증가시킬 수 있게 하였다. 이 기술은 최근 PFC 기능 및 초기 인식5에서SCZ에 연결된 유전자인 보완 성분 4A(C4A)의 원인 역할을 결정하는 데 사용되었다.
여기에 제시된 유전자 전송 접근은 PFC를 포함하여 전두엽 피질에 있는 흥분성 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하는 유전자 전송 접근을 결합하는 실험 적인 파이프라인입니다, 세포 및 회로 수준 변경의 연구 결과를 가능하게 하는 행동 패러다임, 그러나 또한 초기 산후 발달 및 성인기에 걸쳐 행동을 감시할 수 있습니다. 먼저 설명된 방법은 정면 피질 영역에서 층(L) 2/3 피라미드 뉴런의 큰 집단을 양자간 횡단하는 방법이다. 다음으로, 청소년과 성인 마우스의 사회적 행동을 분석하는 작업이 설명되어 있습니다. 세포 수는 세포 형질의 범위와 위치를 정량화하기 위해 행동 작업이 완료되면 얻을 수 있습니다. 더욱이, 전형된 세포의 수는 행동 데이터와 상관관계가 있을 수 있고, 더 많은 수의 전과세포가 행동에 더 큰 혼란을 초래하는지 확인할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본명, 파이프라인은 전두엽 피질 뉴런의 큰 집단에 대한 관심의 새로운 유전자의 조작을 마우스의 행동 분석과 결합하는 것으로 기술된다. 더욱이, 이 파이프라인은 초기 산후 발달 과 성인기에 둘 다 동일 마우스에 있는 행동의 종방향 연구 결과를 허용합니다. 이 기술은 시간과 비용의 관점에서 비용이 많이 들 수 있는 유전 동물 모델에 의지할 필요성을 우회합니다. 이 프로토콜의 강도는 최근 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 중요한 피드백과 원고에 편집 리사 크레츠지 감사합니다. 우리는 행동 두뇌의 관류 및 세포 계산을 돕는 데 귀중한 크루즈 – 마르틴 실험실의 모든 연구 조수에게 감사드립니다. 우리는 삼극성 전극의 디자인에 대한 입력 안드레제이 Cwetsch 감사, 그리고 토드 블루테와 보스턴 대학 생물학 이미징 코어는 공초점 현미경의 사용에 대한. 이 작품은 NARSAD 젊은 조사자 그랜트 (AC-M, #27202), 브렌튼 R. 루츠 상 (ALC), I. 알덴 맥치 상 (ALC), NSF NRT UtB : 신경 광장 국가 연구 펠로우십 (ALC, #DGE1633516), 보스턴 대학 학부 연구 기회 프로그램 (WWY)에 의해 지원되었다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
Materials
| 13mm Silk Black Braided Suture | Havel's | SB77D | Suture skin |
| Adson Forceps | F.S.T. | 11006-12 | IUE |
| C270 Webcam | Logitech | N/A | Record behavior |
| Electroporator | Custom-built | N/A | See Figure 1 and 2 and Bullmann et al, 2015 |
| EZ-500 Spin Column Plasmid DNA Maxi-preps Kit, 20preps | Bio Basic Inc. | BS466 | Pladmid preparation |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | Dye for DNA solution |
| Fine scissors- sharp | F.S.T. | 14060-09 | IUE |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientific | 1376152 | IUE |
| Gaymar Heating/Cooling | Braintree | TP-700 | Heating Pad |
| Glass pipette puller | Sutter Instrument, | P-97 | IUE |
| Glass pipettes | Sutter Instrument, | BF150-117-10 | IUE |
| Hair Removal Lotion | Nair | N/A | Hair removal |
| Hartman Hemostats | F.S.T. | 13002-10 | IUE |
| Open field maze- homemade acrylic arena | Custom-built | N/A | 50 × 50 × 30 cm length-width-height |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | Mammalian expression vector for expression of GFP |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | N/A | pressure injector |
| Retractor – 2 Pronged Blunt | F.S.T. | 17023-13 | IUE |
| Ring forceps | F.S.T. | 11103-09 | IUE |
| Sterilizer, dry bead | Sigma | Z378569 | sterelize surgical tools |
| SUTURE, 3/0 PGA, FS-2, VIOLET FOR VET USE ONLY | Havel's | HJ398 | Suture muscle |
| Water bath | Cole-Parmer | EW-12105-84 | warming sterile saline |
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