Denne protokol afgrænser trin, der er nødvendige for genlevering gennem fokuseret ultralyd blodhjernebarriere (BBB) åbning, evaluering af den resulterende genekspression og måling af neuromodulationsaktivitet af kemogenetiske receptorer gennem histologiske tests.
Akustisk målrettet kemogenetik (ATAC) giver mulighed for ikke-invasiv kontrol af specifikke neurale kredsløb. ATAC opnår en sådan kontrol gennem en kombination af fokuseret ultralyd (FUS) induceret blod-hjerne barriereåbning (FUS-BBBO), genlevering med adeno-associerede virale (AAV) vektorer og aktivering af cellulær signalering med konstruerede, kemogene, proteinreceptorer og deres beslægtede ligander. Med ATAC er det muligt at transducere både store og små hjerneområder med millimeterpræcision ved hjælp af en enkelt ikke-invasiv ultralydsapplikation. Denne transduktion kan senere muliggøre en langsigtet, ikke-invasiv, enhedsfri neuromodulation i frit bevægelige dyr ved hjælp af et lægemiddel. Da FUS-BBBO, AAV’er og kemogenetik er blevet anvendt i flere dyr, bør ATAC også være skalerbar til brug i andre dyrearter. Dette papir udvider en tidligere offentliggjort protokol og skitserer, hvordan man optimerer genleveringen med FUS-BBBO til små hjerneområder med MR-vejledning, men uden behov for en kompliceret MR-kompatibel FUS-enhed. Protokollen beskriver også designet af musemålretnings- og fastholdelseskomponenter, der kan 3D-printes af ethvert laboratorium og let kan ændres til forskellige arter eller brugerdefineret udstyr. For at hjælpe reproducerbarheden beskriver protokollen detaljeret, hvordan mikrobobler, AAV’er og venipunktur blev brugt i ATAC-udvikling. Endelig vises et eksempel på data til vejledning i de indledende undersøgelser af undersøgelser ved hjælp af ATAC.
Brug af kredsløbsspecifikke neuromodulationsteknologier, såsom optogenetik1,2 og kemogenetik 3,4,5, har fremmet vores forståelse af psykiatriske tilstande som neuronale kredsløbsforstyrrelser. Neuronale kredsløb er vanskelige at studere og endnu vanskeligere at kontrollere ved behandling af hjernesygdomme, fordi de typisk defineres af specifikke celletyper, hjerneområder, molekylære signalveje og timing af aktivering. Ideelt til både forskning og kliniske anvendelser ville en sådan kontrol udøves ikke-invasivt, men det er udfordrende at opnå både præcis og ikke-invasiv neuromodulation. For eksempel, mens neuroaktive lægemidler kan nå hjernen ikke-invasivt, mangler de rumlig specificitet ved at virke i hele hjernen. På den anden side kan elektrisk dyb hjernestimulering kontrollere specifikke hjerneområder, men har svært ved at kontrollere specifikke celletyper og kræver kirurgi og enhedsplacering6.
Akustisk målrettet kemogenetik7 (ATAC) giver neuromodulation med rumlig, celletype og tidsmæssig specificitet. Det kombinerer tre teknikker: fokuseret ultralydinduceret blod-hjerne-barriereåbning (FUS-BBBO) til rumlig målretning, anvendelse af adeno-associerede virale vektorer (AAV’er) til ikke-invasivt at levere gener under kontrol af celletypespecifikke promotorer og konstruerede kemogenetiske receptorer til selektivt at modulere transfekterede neurale kredsløb via lægemiddeladministration. FUS er en FDA-godkendt teknologi, der udnytter ultralydets evne til at fokusere dybt inde i væv, herunder den menneskelige hjerne, med millimeter rumlig præcision. Ved høj effekt anvendes FUS til ikke-invasiv målrettet ablation, herunder en FDA-godkendt behandling for essentiel tremor8. FUS-BBBO kombinerer ultralyd med lav intensitet med systemisk administrerede mikrobobler, som svinger i blodkar ved ultralydfokus, hvilket resulterer i lokaliseret, midlertidig (6-24 timer) og reversibel åbning af BBB9. Denne åbning muliggør levering af proteiner 9,10, små molekyler 11 og virale vektorer7,12,13,14 til hjernen uden væsentlig vævsskade hos gnavere 10 og ikke-menneskelige primater 15. Kliniske forsøg er i gang for FUS-BBBO16,17, hvilket indikerer mulige terapeutiske anvendelser af denne teknik.
Viral genlevering ved hjælp af AAV udvikler sig også hurtigt til klinisk brug for CNS-lidelser, med nylige FDA- og EU-regulatoriske godkendelser som vigtige milepæle. Endelig anvendes kemogenetiske receptorer18, såsom designerreceptorer, der udelukkende aktiveres af designerlægemidler (DREADD’er), i vid udstrækning af neuroforskere til at tilvejebringe farmakologisk kontrol over neuronal excitation hos transgene eller transfekterede dyr19,20. DREADD’er er G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er), der er genetisk manipuleret til at reagere på syntetiske kemogenetiske molekyler snarere end endogene ligander, således at systemisk administration af disse ligander øger eller reducerer excitabiliteten af DREADD-ekspressive neuroner. Når disse tre teknologier kombineres i ATAC, kan de bruges til ikke-invasiv modulering af udvalgte neurale kredsløb med rumlig, celletype og tidsmæssig præcision.
Her udvider og opdaterer vi en tidligere offentliggjort protokol for FUS-BBBO11 ved at inkludere metoder til nøjagtig målretning af hjerneområder med FUS-BBBO i mus ved hjælp af simpelt 3D-printet målretningsudstyr. Vi viser også en anvendelse af FUS-BBBO til ATAC. Vi viser trin, der er nødvendige for levering af AAV’er, der bærer kemogenetiske receptorer, og evaluering af genekspression og neuromodulation ved histologi. Denne teknik er især anvendelig til at målrette mod store eller flere hjerneområder til genekspression eller neuromodulation. For eksempel kan et bredt område af en cortex let transduceres med FUS-BBBO og moduleres ved hjælp af kemogenetik. Genlevering med en alternativ teknik, intrakranielle injektioner, ville imidlertid kræve et stort antal invasive injektioner og kraniotomier. FUS-BBBO og dens anvendelse, ATAC, kan skaleres til dyr af forskellig størrelse, hvor hjerneområder er større og sværere at målrette invasivt.
ATAC kræver en vellykket implementering af flere teknikker til vellykket neuromodulation af specifikke neurale kredsløb, herunder nøjagtig MR-guidet målretning, FUS-BBBO og histologisk evaluering af genekspression. 3D-printbare komponenter blev udviklet for at forenkle målretning af små hjernestrukturer med billeddannelsesstyret FUS-BBBO.
MR-guidet fokuseret ultralyd (MRIgFUS) administration udgør en række udfordringer. For det første har typisk MR-spole begrænset plads, der er designet til kun at rumme en prøve og ikke ultralydhardwaren. De større boringer af MR’er øger omkostningerne ved udstyr og reducerer billedkvaliteten, da signalet er relateret til fyldningsfaktoren for en spole32. Derfor vil enhver FUS-hardware, der placeres oven på et dyrebillede i MR, kompromittere billedkvaliteten. For det andet er det vanskeligt og dyrt at designe MR-kompatible enheder. MR-kompatible materialer skal være diamagnetiske, have lav tilbøjelighed til at skabe hvirvelstrømme under radiofrekvensbestråling og have lav magnetisk modtagelighed i høje magnetfelter. I ethvert ledende materiale vil skabelsen af hvirvelstrømme eller dets magnetiske modtagelighed også påvirke billedkvaliteten negativt. Endelig har de tilgængelige MR-kompatible materialer lavere Youngs moduli og holdbarhed end de metaller, der typisk anvendes til fremstilling af præcise målretningsmaskiner, f.eks. stereotaksiske rammer. Motorerne, der bruges til positionsjusteringer, skal være MR-kompatible og placeres uden for MR-boringen på grund af deres størrelse. Disse motorer skal tilsluttes i en afstand til transduceren inde i en MR-boring ved hjælp af MR-kompatible materialer. Problemer med plastisk vridning, mangel på tilstrækkelig plads inde i boringen til at implementere komponenter i robust størrelse og utilstrækkelig plads til at ændre målretningspositioner på tværs af hele hjernen har påvirket målretningsnøjagtigheden i tidligere arbejde.
For at løse disse problemer blev det besluttet at udføre billeddannelse i MR- og FUS-BBBO-administration uden for scanneren. For at muliggøre MR-vejledning blev mus placeret inde i en 3D-printet fastholdelse, der havde en MR-synlig målretningsguide, der kunne bruges til at lokalisere musehjernestrukturerne både i MR og i stereotax-koordinatrummet. Da både musekraniet og målretningsguiden er fastgjort til ørestangholdere (figur 1a,b), kan en målretningsguide bruges til at korrelere rumlige koordinater inden for MR-billedet og nulstille de stereotaksiske instrumenter. Fastholdelsen har ikke bevægelige dele og indeholder ikke en transducer, hvilket gjorde det muligt for os at gøre den både robust og tilstrækkelig lille til at passe ind i en MR og fjernede signalinterferens fra transducerens elektronik. Pladsen inde i målretningsguiden er blevet udhulet, da den 3D-printede understøttelse af nogle materialer er synlig i MR (figur 1c). Huller i samlingen blev indført for at muliggøre stereotaxkalibrering (figur 3). Ultralydstransduceren blev fastgjort til en elektrodeholder af en stereotax, og målretning blev udført som beskrevet i afsnit 4 (figur 1d). Transduceren skal understøttes langs dens længde af ørestænger, hvilket forhindrer enhver afvigelse fra planplanet. Målretningen i dorso-ventral retning kan opnås ved hjælp af faseforskydninger i et ringformet array.
Den praktiske målretningspræcision bestemmes af ultralydsfokusering og kraniedæmpning. FUS-BBBO-proceduren er detaljeret beskrevet for rotter 11 og er implementeret i en række andre modelorganismer23,33,34 og hos mennesker 16,17. Forholdet mellem ultralydsfokusstørrelse omvendt proportional med frekvens, hvor højere frekvenser kan resultere i mere præcis levering. Imidlertid øges dæmpningen af kraniet med frekvenser35, hvilket kan føre til kranieopvarmning og beskadigelse af de kortikale områder. Den nøjagtige målretningsstrategi afhænger af hjernens websted. De steder, hvor et halvt maksimalt tryk i fuld bredde passer ind i hjernevævet, giver mulighed for forudsigelig og sikker BBB-åbning i mange hjernestrukturer såsom striatum, mellemhjerne og hippocampus. Regioner nær bunden af hjernen udgør en særlig udfordring hos mus. Musens hjerne måler ca. 8-10 mm i dorso-ventral retning, hvilket kan sammenlignes med den fulde bredde halv maksimale størrelse af mange kommercielt tilgængelige transducere. Derfor kan målretning i bunden af kraniet føre til ultralydsrefleksion fra knogler og luft, der er til stede i øregangene, munden eller luftrøret, hvilket kan føre til uforudsigelige mønstre af høje og lave tryk36. Nogle af disse tryk kan krydse en inertial kavitationstærskel, som har vist sig at forårsage blødning og vævsskade37. For at målrette regioner, der er placeret nær bunden af kraniet, kan det være at foretrække at bruge intersektionel ATAC7, hvor intersektionel genetik38 bruges til at begrænse genekspression til et mindre område end det, der er målrettet med FUS-stråle. I det offentliggjorte eksempel på intersektionel ATAC er et transgent dyr, der udtrykker et genredigeringsenzym (Cre38) i dopaminerge celler, blevet målrettet med ultralyd i underafsnittet af regionen, der indeholder dopaminerge celler. Endelig kan de kortikale regioner målrettes med FUS, men diffraktion og refleksion af ultralyd kan forekomme, hvilket fører til ujævne trykprofiler. Denne protokol dækker ikke målretning mod kortikale regioner, da den vil være stærkt afhængig af de anvendte arter. Imidlertid er der observeret en vis målretning af cortex over hippocampus 7 (f.eks. Figur 7), hvilket indikerer, at det i det mindste hos mus er muligt.
Valget af en kemogenetisk aktivator og dosering afhænger af de specifikke eksperimentelle behov. En række undersøgelser, herunder en af forfatternes undersøgelser7, viste ingen signifikant ikke-specifik respons39,40, mens højere doser (f.eks. 10 mg / kg) kan give bivirkninger, i det mindste i nogle tilfælde41. Men som med alle adfærdseksperimenter er korrekt kontrol31 afgørende på grund af potentiel off-målrettet aktivitet af CNO og dets metabolitter42. Sådanne kontroller kan omfatte administration af CNO og saltvandskontrol til dyr, der udtrykker DREADD’er, og administration af CNO til vildtypedyr eller i nogle specifikke tilfælde en sammenligning af ipsi- og kontralaterale steder i hjernen, der henholdsvis udtrykker kemogenetiske receptorer og ikke udtrykker deme. Derudover afslørede nyere forskning en række nye DREADD-agonister med forbedret specificitet28,29,43. Andre kemogenetiske receptorer 5,25,44 kan også anvendes sammen med ATAC-proceduren.
Histologisk vurdering af genekspression er nødvendig post mortem for hvert dyr. En lille brøkdel af dyrene viser dårlig genekspression efter FUS-BBBO7. Derudover er det nødvendigt at vise den rumlige nøjagtighed og specificitet af genekspression, da fejlmålretning er mulig. Bemærk, at nogle AAV’er kan vise retrograd eller anterograd sporingsevne45 og kan forårsage transfektion langt fra det sted, der er målrettet mod ultralyd på trods af nøjagtig ultralydmålretning. Hvis den udtrykte kemogenetiske receptor er smeltet sammen med eller co-udtrykker en fluorofor, kan billeddannelse af fluoroforen i vævssektioner være tilstrækkelig til at evaluere lokalisering og ekspressionsintensitet. Imidlertid er mange fluorescerende proteiner beskadiget af vævsfikseringsprocessen, og immunfarvning for mCherry-protein, der ofte bruges med DREADD’er, gav bedre signal i tidligere undersøgelser7. Endelig kan det på grund af tætheden af neuroner i visse dele af hjernen (f.eks. granulært cellelag i hippocampus) være gavnligt at anvende nuclear-lokaliserede fluoroforer udtrykt under IRES, i modsætning til fusioner, til at udføre celletællinger, da kerner let kan segmenteres og modfarves med nukleare pletter, såsom DAPI eller TO-PRO-3. At evaluere neuromodulation ved c-Fos-farvning, udføre nuklear modfarvning og tælle c-Fos-positive kerner snarere end noget fluorescenssignal er bydende nødvendigt. I nogle tilfælde kan cellulært affald vise fluorescens og forvirre målingerne af positive celler.
Begrænsninger af lægemiddel- og genafgivelse med FUS-BBBO inkluderer lavere opløsning end levering med invasive intrakranielle injektioner og behovet for større mængder injicerede lægemidler eller virale vektorer. Derudover, mens en direkte injektion i hjernen resulterer i eksklusiv levering til et injiceret sted, bruger FUS-BBBO en intravenøs vej, hvilket resulterer i mulig levering til perifert væv. Begrænsninger ved brug af kemogenetik til neuromodulation omfatter en langsom tidsplan, som kan være utilstrækkelig til nogle adfærdsmæssige protokoller, der kræver hurtige ændringer i intensiteten af neuromodulation.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Flere 3D-printede komponenter blev oprindeligt designet af Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrig). Forfatteren takker John Heath (Caltech) og Margaret Swift (Caltech) for teknisk hjælp med at forberede manuskriptet.
21-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826C | |
25-gauge butterfly catheter | Harvard Bioscience | 725966 | |
30-gauge needles (BD) | Fisher Scientific | 14826F | |
Absorbent blue pad | Office Depot | 902406 | |
Anti-c-Fos antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-253-G | |
Anti-mCherry antibody | Thermofisher | PA534974 | |
Bruker Biospec 70/30 | Bruker | custom | includes the RF coils |
Clozapine-n-oxide | Tocris | 4936 | |
Custom designed 3D printed mouse harnesses and MRIgFUS targeting components | ImageGuidedTherapy, Szablowski lab | custom | download from szablowskilab.org/downloads |
Custom MRIgFUS machine | ImageGuidedTherapy | N/A | |
Definity microbubbles | Lantheus | DE4 | |
Degassed aquasonic/ultrasound gel | Fisher Scientific | 5067714 | |
Depilation crème | Nair | n/a | |
Eight-element annular array transducer | Imasonic Inc. | custom | |
Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD) | Office Depot | 599893 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Ketamine | Patterson Veterinary | 07-890-8598 | |
Neutral buffered formalin (10%) | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
Optical fiber hydrophone | Precision Acoustics | ||
PE10 tubing | Fisher Scientific | NC1513314 | |
Peristaltic pump | |||
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 524650-1EA | |
Prohance contrast agent | Bracco | 0270-1111-04 | |
Saline | Fisher Scientific | NC9054335 | |
Secondary antibody, Donkey-anti goat | ThermoFisher | A-11055 | |
Secondary antibody, Donkey-anti rabbit | ThermoFisher | 84546 | |
Surgical scissors (straight) | Fisher Scientific | 17467480 | |
ThermoGuide Software | ImageGuidedTherapy | ||
Tissue glue (Gluture) | Fisher Scientific | NC9855218 | |
Tuberculin Syringe (1 mL) (BD) | Fisher Scientific | 14823434 | |
VeroClear 3D printable material | Stratasys | RGD810 | |
Vialmix microbubble activation device | Lantheus | VMIX | |
Vibrating microtome | Compresstome | VF-300 | |
Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251-1G |