Live-Cell Forward genetisk tilgang til at identificere og isolere udviklings mutanter i Klamydia trachomatis
Summary
Denne protokol udnytter fluorescerende promotor-journalister, levende celle mikroskopi, og individuel optagelse ekstraktion i en rettet frem genetisk tilgang til at identificere og isolere udviklingsmæssige mutanter af Chlamydia trachomatis.
Abstract
Det intracellulære bakteriepatogen Chlamydia trachomatis gennemgår en udviklingscyklus bestående af to morfologisk diskrete udviklingsformer. Den ikke-replikerende elementære krop (EB) initiere infektion af værten. Når inde, EB differentierer i reticulate kroppen (RB). RB gennemgår derefter flere runder af replikation, før differentiere tilbage til den smitsomme EB form. Denne cyklus er afgørende for klamydial overlevelse som manglende skifte mellem celletyper forhindrer enten vært invasion eller replikering.
Begrænsninger i genetiske teknikker på grund af klamydias forpligte intracellulære karakter har hæmmet identifikationen af de molekylære mekanismer, der er involveret i celle-type udvikling. Vi har designet et nyt dobbelt promotor-reporter plasmid system, der sammen med live-celle mikroskopi, giver mulighed for visualisering af celletype skift i realtid. For at identificere gener, der var involveret i reguleringen af celletypeudvikling, blev det levende cellepromotor-reporter-system gearet til udvikling af en fremadrettet genetisk tilgang ved at kombinere kemisk mutagenese af den dobbelte reporterstamme, billeddannelse og sporing af Klamydia med ændret udviklingskinetik efterfulgt af klonal isolering af mutanter. Denne fremadrettede genetiske arbejdsgang er et fleksibelt værktøj, der kan ændres til direkte forhør i en bred vifte af genetiske veje.
Introduction
Klamydia trachomatis (Ctr) er et obligat intracellulært patogen, der skrider frem gennem en bifasisk udviklingscyklus, der er afgørende for dets overlevelse og spredning1. Denne cyklus består af to udviklingsmæssige former, den elementære krop (EB) og reticulate kroppen (RB). EB er replikering inkompetente, men formidler celle invasion gennem effektor induceret endocytose2. Når i værten, EB modnes til repliktive RB. RB udfører flere runder af replikation før konvertering tilbage til EB for at indlede efterfølgende runder af infektion.
Den begrænsede vifte af genetiske værktøjer har begrænset det meste af den klamydial forskning til biokemiske undersøgelser eller brugen af surrogat systemer. Som følge heraf har det været vanskeligt at belyse genregulering og kontrol medudviklingscyklussen 3,4. En af de vigtigste udfordringer på klamydialområdet er den tidsmæssige sporing af den klamydiale udviklingscyklus med høj opløsning og identifikationen af de proteiner, der er involveret i reguleringen. Genekspression under den klamydiale udviklingscyklus er traditionelt blevet udført ved destruktive “endepunkt” metoder, herunder RNAseq, qPCR, og fast celle mikroskopi5,6. Selv om disse metoder har givet uvurderlige oplysninger, er de anvendte teknikker møjsommelige og har lavtidsmæssig opløsning 5,6.
Inden for det seneste årti har genetisk manipulation af Ctr udviklet sig med indførelsen af plasmid transformation og metoder til mutagenese7,8,9. Til denne undersøgelse, en plasmid-baseret system blev udviklet til at overvåge klamydial udvikling i individuelle indeslutninger i realtid i løbet af en infektion. En klamydial transformant blev skabt, der udtrykte både en RB og EB celle-type specifik promotor-reporter. RB specifikke reporter blev bygget ved at sammensmelte initiativtageren til den tidlige RB gen euo opstrøms for fluorescerende protein Clover. EUO er en transskriptionel regulator, der undertrykker en delmængde af sene EB-tilknyttede gener10. Initiativtageren til hctB, som koder en histone-lignende protein, der er involveret i EB nukleoid kondens, blev klonet direkte opstrøms for mKate2 (RFP) for at skabe EB specifikke reporter11. Rygraden for hctBprom-mKate2/euoprom-Clover var p2TK2SW27. HctB og euo promotorer blev forstærket fra Ctr-L2 genomisk DNA. Hver promotorsekvens bestod af ~100 basispar opstrøms for det forventede transskriptionsstartsted for det angivne klamydiale gen plus de første 30 nukleotid (10 aminosyrer) af den respektive ORF. De fluorescerende FP varianter blev kommercielt opnået som Ctr codon optimeret genblokke og klonet i ramme med de første 30 nukleotid af hver klamydial gen og promotor. Ind terminatoren blev klonet direkte nedstrøms for mKate2. Den anden promotor-reporter blev indsat nedstrøms for incD terminator. Ampicillinresistensgen (bla) i p2TK2SW2 blev erstattet med aadA-genet (Spectinomycin resistens) fra pBam4. Dette resulterede i den endelige konstruktion p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figur 1A), der blev omdannet til Ctr-L27. Denne RB/EB-reporterstamme gjorde det muligt at observation af udviklingscyklussen i enkeltslutninger ved hjælp af levende cellemikroskopi (figur 1B,C).
Beskæftiger vores promotor-reporter konstruere i kombination med kemisk mutagenese, en protokol blev udtænkt til at spore og isolere individuelle kloner, der udstillede udviklingsmæssige abnormiteter fra mutageniserede populationer af Ctr serovar L2. Denne protokol giver mulighed for direkte overvågning af individuelle klamydiale indeslutninger, sporing af genekspressionsprofiler over tid, identifikation af klamydiale kloner, der udtrykker et ændret udviklingsgenkspressionsmønster, og klonal isolering af klamydia fra individuelle indeslutninger.
Selv om denne protokol er blevet oprettet specielt til identifikation af gener, der er involveret i klamydial udvikling, det kunne let tilpasses til at afhøre et vilkårligt antal klamydiale genetiske veje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dissekere de mekanismer, der styrer den klamydiale udviklingsmæssige cyklus er blevet hæmmet af begrænsningerne i de aktuelt tilgængelige genetiske værktøjer. Ved at anvende vores promotor-reporter Chlamydia i forbindelse med live-celle automatiseret mikroskopi, et system blev bygget, som gør det muligt at overvåge celle-type udvikling i individuelle indeslutninger over en 24 timer periode. Dette system har i kombination med kemisk mutagenese og isolation af direkte inklusion etableret en metode til hurt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Anders Omsland på Washington State University for at levere CIP-1 axenic medier. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskuddet R01AI130072, R21AI135691 og R21AI113617. Yderligere støtte blev ydet af startfonde fra University of Idaho og Center for Modeling Complex Interactions gennem deres NIH tilskud P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. . Collaborative data science. , (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
