Denne protokol beskriver mikroinjection procedurer for Culex quinquefasciatus embryoner, der er optimeret til at arbejde med CRISPR/Cas9 genredigeringsværktøjer. Denne teknik kan effektivt generere stedsspecifikke, arvelige, kønsceller mutationer, der kan bruges til at opbygge genetiske teknologier i denne understudied sygdom vektor.
Culex quinquefasciatus er en vektor for en bred vifte af vektorbårne sygdomme som aviær malaria, West Nile virus (WNV), japansk encephalitis, østlig hesteencephalitis, lymfefilariasis og Saint Louis encephalitis. Især har aviær malaria spillet en stor rolle i udryddelsen af talrige endemiske ø fuglearter, mens WNV er blevet en vigtig vektorbåren sygdom i USA. For at få yderligere indsigt i C. quinquefasciatus biologi og udvide deres genetiske kontrol værktøjskasse, er vi nødt til at udvikle mere effektive og overkommelige metoder til genomteknik i denne art. Men nogle biologiske træk unikke for Culex myg, især deres æg flåder, har gjort det vanskeligt at udføre mikroinjection procedurer, der kræves for genom engineering. For at løse disse udfordringer har vi udviklet en optimeret embryomikrojectionprotokol, der fokuserer på at afbøde de tekniske hindringer, der er forbundet med Culex myggenes unikke egenskaber. Disse procedurer demonstrere optimerede metoder til æg indsamling, æg tømmerflåde adskillelse og andre håndteringsprocedurer afgørende for en vellykket mikroinjection i C. quinquefasciatus. Når disse procedurer kombineres med CRISPR/Cas9-genomredigeringsteknologien, giver de os mulighed for at opnå stedsspecifikke, effektive og arvelige kønsceller mutationer, som er nødvendige for at udføre avanceret genomteknologi og udvikle genkontrolteknologier i denne vigtige, men i øjeblikket understudiede sygdomsvektor.
C. quinquefasciatus, almindeligvis kendt som det sydlige hus myg, er en kompetent vektor af mange patogener, herunder West Nile virus (WNV), japansk encephalitis, Saint Louis encephalitis, og østlige heste encephalitis. Især siden det første gang blev opdaget i New York i 1999, er WNV blevet en stor vektorbåren sygdom i hele det kontinentale USA (USA) med over 50.000 rapporterede humane tilfælde, der resulterede i omkring 2.300 dødsfald mellem 1999 og 20181 samt over 4.500 rapporterede hestetilfælde mellem 2008-20192. Desuden er mindst 23 fuglearter, der findes i Nordamerika, blevet påvirket af WNV-infektioner med mindst 12 arter, der er klassificeret som uoprettelige som følge af WNV3. Virkningen af WNV på mennesker, heste og fuglepopulationer skyldes den opportunistiske fodringsadfærd hos sine vektorer. Fugle er typisk de primære værter for WNV, og mennesker og heste er tilfældige eller blindgyde værter. Nogle patogener vektoreret af C. quinquefasciatus inficerer kun fugle som fugle malariaparasit, Plasmodium relictum. I Hawaii, C. quinquefasciatus er en hovedvektor for fugle malaria og har forårsaget udryddelsen af mange indfødte fuglearter4,5.
For at bekæmpe sygdomme, der overføres af C. quinquefasciatus, forskere og vektorkontrolagenturer, har brugt almindeligt etablerede mygpopulationskontrolværktøjer som insekticidapplikation6, men disse metoder er dyre, ikke artsspecifikke og har begrænset effektivitet, da resistens over for insekticider er høj i mange C. quinquefasciatuspopulationer 6,7,8,9. Andre kontrolteknikker, såsom Wolbachia-baseredebefolkningskontrolstrategier, er blevet udviklet i de senere år10,11, men fitnessomkostningerne forbundet med Wolbachia-infektion begrænser gennemførligheden af denne tilgang til denne vektor12. Der er også genetisk baserede kontrolmetoder, der er udviklet i andre mygarter som Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 og Anopheles stephensi16, herunder udvikling af patogenresistente myg17,18,19, der også kunne udvikles til C. quinquefasciatus, hvis de nødvendige genomteknologiske værktøjer er udviklet til denne art. Men C. quinquefasciatus biologi adskiller sig meget fra andre Aedes og Anopheles myg vektorer, som har gjort udviklingen af lignende genetiske teknologier vanskeligt i denne vektor. Med fremkomsten af CRISPR-baserede genomteknologier er præcis genomteknik blevet stadig triviel, overkommelig og tilpasningsdygtige og har derfor ført til udvikling af nye genetiske værktøjer i en lang række arter.
For at generere mutationer med CRISPR-baserede teknologier, en blanding af Cas9 protein og syntetisk guide RNA (sgRNA), der supplerer den ønskede loci, er microinjected i præ-blastoderm fase embryoner. Da C. quinquefasciatus hunner lægger deres æg i grupper fastgjort i en flydende flådestruktur (figur 1), i modsætning til at ovipositing individuelle æg, er et træk ved Aedes og Anopheles myg, embryo mikroinjections stadig mere komplicerede i denne art. Culex larver kommer også ud af den forreste side af hvert æg, som er i kontakt med vandoverfladen (Figur 1), så ægorientering efter manipulation er vigtig i denne art. Her beskriver vi en detaljeret protokol designet til mikroinjection af Cas9 protein og sgRNA i C. quinquefasciatus embryoner. Denne protokol er designet til at rumme træk, der er unikke for Culex biologi for at forbedre embryoets overlevelse og genommutationshastigheder gennem visse trin, der er nøglen til rettidig ægopsamling og ægoverlevelse.
Med de seneste bestræbelser på at generere genetisk manipulerede værktøjer til myg vektor kontrol, er der behov for at udvikle og optimere embryo mikroinjection protokoller for fælles myg sygdom vektorer. Selvom der er udviklet metoder til Aedes og Anopheles myg, er en protokol designet specielt til Culex blevet minimalt udforsket. Generelt kan myggefostrindsprøjtningsprotokoller opdeles i 3 generelle trin: 1) embryonindsamling og -forberedelse, 2) embryoindsprøjtning og 3) genopretning efter injektion. For at kunne generere mutanter skal alle tre trin optimeres til målarten. Denne modificerede protokol for embryo mikroinjection er specifik for vellykket genom engineering af Culex myg.
Maksimering af embryonindsamling er en almindelig flaskehals i embryomikroinjectionprotokoller. For at øge antallet af æg indsamlet på kort tid blev myg begrænset fra et ovipositionssubstrat i 2-3 dage efter blodmåltidet. Det er vigtigt at bemærke, at C. quinquefasciatus tendens til at foretrække fugleblod kilder i modsætning til pattedyr kilder eller membran fodring med pattedyr blod. Men mange forskere har svært ved at erhverve en pålidelig kilde til levende fugle eller fugleblod til blodfodring, så laboratorielagre kan tilpasses til at fodre på mere tilgængelige blodkilder. Det er også vigtigt at bruge næringsrigt vand til oviposition substrat, da det giver oviposition stikord til C. quinquefasciatus og de fleste andre Culex vektorer. Der er mange metoder til at generere næringsrigt vand, som muligvis skal optimeres mellem laboratorier for at sikre, at et passende antal æg er tilgængelige for mikroinjection. For eksempel, mens denne metode var den mest succesfulde med kaninafføring fermenteret i deioniseret vand i 5 eller flere dage, har andre forskere mere succes med græs eller fiskefoder som næringsstofkilde og nogle endda med destilleret vand21.
Da Culex myg lægger grupper af æg i flåder, er indsamling af æg ret simpelt. Æg kan simpelthen indsamles ved at scooping hele flåden med en pensel. Ægadskillelse er mere kompliceret, men afgørende for en vellykket injektion. Æg kan omhyggeligt adskilles fra flåden ved at anvende blidt nedadgående tryk mellem æg med pensel eller pincet. Med en vis praksis var flere brugere pålideligt i stand til at adskille enkeltæg fra ægflåder. Efter adskillelse af hvert æg justeres æggene i samme retning på dobbeltsidet klæbebånd, som stabiliserer æggene under mikroinjektion. Æg injiceres i den koniske bageste ende, og tilsætningen af halocarbonolie holder æggene fugtige under manipulation.
For at begrænse skader på embryoner under mikroinjektion skal injektionsnåle være af passende styrke og facetteres i en passende vinkel. Aluminosilicate nåle facetteret i 10 sekunder i en 50 ° vinkel havde de bedste resultater, men borosilikat og kvarts nåle kan også arbejde, selv om de kan være billigere og dyrere. Derudover letter korrekt nålesvingning bedre strømning af Cas9- og sgRNA-blandingerne og skaber et skarpere punkt for lettere indtrængning i embryoet. I mange tilfælde er facet også en effektiv måde til hurtigt at fastsætte tilstoppede nåle i stedet for at bruge tid og kræfter på at erstatte tilstoppede nåle.
Efter injektionen skal æggene forblive uforstyrrede i mindst 5 minutter, mens halocarbonolien fjernes umiddelbart efter ved forsigtigt at børste den væk med en ren pensel. Efter fjernelse af halocarbonolien kan de injicerede æg placeres i vand for at klække, hvilket typisk sker inden for 3 dage efter injektionen. Med praksis og tilstrækkeligt antal æg kan denne protokol opnå konsekvente somatiske og kønsceller mutationer i C. quinquefasciatus og er alsidig nok til, at den let kan tilpasses andre Culex-myg.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af UCSD-startmidler rettet mod O.S.A.
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |