Er wordt beschreven dat een methode wordt beschreven om organoïden te maken met behulp van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) voor in vitro screening, wat resulteert in overeenkomende paren in vivo/in vitro modellen. PDX-tumoren werden mechanisch of enzymatisch in kleine stukjes geoogst/verwerkt, gevolgd door de Clevers'-methode om tumororganoïden te kweken die werden gepasseerd, cryopreserved en gekarakteriseerd tegen de oorspronkelijke PDX.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) worden beschouwd als de meest voorspellende preklinische modellen, grotendeels verondersteld te worden aangedreven door kanker stamcellen (CSC) voor conventionele kanker drug evaluatie. Een grote bibliotheek van PDX's weerspiegelt de diversiteit van patiëntenpopulaties en maakt zo populatiegebaseerde preklinische studies mogelijk ("Fase II-achtige muis klinische studies"); PDX heeft echter praktische beperkingen van lage doorvoer, hoge kosten en lange duur. Tumororganoïden, ook door de patiënt afgeleide CSC-gestuurde modellen, kunnen worden beschouwd als het in vitro equivalent van PDX, waarmee bepaalde PDX-beperkingen voor het omgaan met grote bibliotheken van organoïden of verbindingen worden overschreden. Deze studie beschrijft een methode om PDX-afgeleide organoïden (PDXO) te maken, wat resulteert in gekoppelde modellen voor in vitro en in vivo farmacologisch onderzoek. Subcutaan getransplanteerde PDX-CR2110 tumoren werden verzameld van tumordragende muizen toen de tumoren 200-800 mm3bereikten, volgens een goedgekeurde autopsieprocedure, gevolgd door verwijdering van de aangrenzende niet-tumorweefsels en dissociatie in kleine tumorfragmenten. De kleine tumorfragmenten werden gewassen en door een 100 μm celzeef gepasseerd om het puin te verwijderen. Celclusters werden verzameld en opgehangen in keldermembraanextract (BME) oplossing en geplateerd in een 6-put plaat als een vaste druppel met omringende vloeibare media voor groei in een CO2 incubator. Organoïde groei werd tweemaal per week gecontroleerd onder lichte microscopie en opgenomen door fotografie, gevolgd door vloeibare mediumverandering 2 of 3 keer per week. De gekweekte organoïden werden verder gepasseerd (7 dagen later) in een verhouding van 1:2 door de BME ingebedde organoïden te verstoren met behulp van mechanisch scheren, geholpen door toevoeging van trypsine en de toevoeging van 10 μM Y-27632. Organoïden werden cryopreserved in cryo-buizen voor langdurige opslag, na versie van BME door centrifugation, en ook bemonsterd (b.v., DNA, RNA en FFPE blok) voor verdere karakterisering.
Inleiding
Kankers zijn een verzameling van verschillende genetische en immunologische aandoeningen. Succesvolle ontwikkeling van effectieve behandelingen is sterk afhankelijk van experimentele modellen die klinische resultaten effectief voorspellen. Grote bibliotheken van goed gekarakteriseerde patiënt-afgeleide xenografts (PDX) worden al lang gezien als het translationele in vivo systeem bij uitstek om chemo- en/of gerichte therapieën te testen vanwege hun vermogen om patiënttumorkenmerken, heterogeniteit en respons van patiëntengeneesmiddelen samen tevatten 1, waardoor fase II-achtige muis klinische studies het klinische succes kunnen verbeteren
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle protocollen en wijzigingen of procedures met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren werden voorafgaand aan het uitvoeren van de studies beoordeeld en goedgekeurd door het Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De verzorging en het gebruik van dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met aaalac (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internationale richtlijnen zoals gerapporteerd in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council (2011). Alle dierproefprocedures werden onder steriele omstandigheden uitgevoerd in SPF-faciliteiten (specifieke ziekteverwekk....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Morfologie van PDXA's, typisch voor organoïden onder lichte microscopie, en consistent met ouderlijke PDX per H&E-kleuring
Onder lichte microscopie vertoont PDXO-CR2110 typische cystische morfologie (figuur 1A), zoals eerder beschreven voor patiënt-afgeleide organoïden (BOB), bewijs dat de gelijkenis tussen PDXO en BOB onder dezelfde kweekomstandigheden ondersteunt.
Histopathologisch onderzoek door H&E-kleuring toont aan dat de weefselstructure.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De voorlopige gegevens voor PDX-/PDXO-CR2110 in dit rapport ondersteunen de biologische gelijkwaardigheid tussen PDX en zijn derivaat PDXO, met betrekking tot genomica, histopathologie en farmacologie, aangezien beide modellen de ziektevormen vertegenwoordigen die zijn afgeleid van de oorspronkelijke CSC van de patiënt. Beide modellen zijn patiënt-afgeleide ziektemodellen, potentieel voorspellend voor de klinische respons van patiënten10,11,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs zijn de huidige fulltime medewerkers van Crown Bioscience, Inc.
Dankbetuigingen
De auteurs willen Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi en Rajendra Kumari bedanken voor het kritisch lezen en redigeren van het manuscript. De auteurs willen ook het Crown Bioscience Oncology in vitro en in vivo team bedanken voor hun grote technische inspanningen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Basismedium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Wassmedium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Tumor verteren |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoïde kweekmatrix (Basement Membrane Extract, groeifactor verminderd) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoïde kweekmedium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoïde kweekmedium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoïde kweekmedium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoïde kweekmedium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoïde kweekmedium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoïde kweekmedium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoïde kweekmedium |
| Gastrine | Sigma | G9145 | Organoïde kweekmedium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoïde kweekmedium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoïde kweekmedium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoïde kweekmedium |
| penicilline-streptomycine | Life Technologies | 15140122 | Organoïde kweekmedium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoïde kweekmedium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screeningsassay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screeningsassay (luminescerend ATP-indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Organoïde platen/CellTiter-Glo 3D toevoeging |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Verbinding toevoeging |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescentie meting |
| Balb/c naaktmuizen | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA zuiveringskit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA zuiveringskit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoïde inbedding |
Referenties
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening us....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
