यहां, हमने हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के एक्सॉन प्रारंभिक खंडों (एआईएस) की असेंबली और संरचना का मात्रात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जिसमें एक विशाल एंकिरिन-जी की अनुपस्थिति के कारण पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।
न्यूरोनल एक्सॉन प्रारंभिक खंड (एआईएस) कार्रवाई क्षमता की शुरुआत की साइटें हैं और उनकी आणविक संरचना, असेंबली और गतिविधि पर निर्भर प्लास्टिसिटी के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। विशाल ankyrin-जी, AIS के मास्टर आयोजक, झिल्ली फैले वोल्टेज gated सोडियम (VSVG) और पोटेशियम चैनलों (KCNQ2/3), साथ ही साथ १८६ केडीए न्यूरोफैसिन, एक L1CAM सेल आसंजन अणु के साथ सीधे सहयोगियों । विशालकाय एंकिरिन-जी बीटा-4-स्पेक्ट्रिन, और माइक्रोट्यूबुले-बाइंडिंग प्रोटीन, ईबी 1/ईबी3 और Ndel1 सहित साइटोप्लाज्मिक एआईएस अणुओं को भी बांधता है और भर्ती करता है। विशालकाय एंकिरिन-जी एंकिरिन-जी की कमी न्यूरॉन्स में एआईएस गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। एंकिरिन-जी में एआईएस के बजाय डेंड्रिटिक कताई में स्थित एक छोटा 1 9 0 केडीए आइसोफॉर्म भी शामिल है, जो एआईएस को लक्षित करने या एआईएस को एंकिरिन-जी-कमी न्यूरॉन्स में एआईएस को बचाने में असमर्थ है। यहां, हमने ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया, जो क्रे-बीएफपी से संक्रमित होने पर एंकिरिन-जी के सभी आइसोफॉर्म का नुकसान होता है और एआईएस के गठन को ख़राब करता है। एक संशोधित बैंकर ग्लिया/न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को संयुक्त करते हुए, हमने 480 केडीए एंकिरिन-जी-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के साथ एंकिरिन-जी नल न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करने के लिए एक विधि विकसित की है, जो एआईएस के गठन को बचाने के लिए पर्याप्त है। हम हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृतियों में होने वाले न्यूरोनल सेल निकायों से एआईएस दूरी में भिन्नता से निपटने के लिए साल्जर और सहयोगियों द्वारा विकसित एक मात्राकरण विधि को नियोजित करते हैं। यह प्रोटोकॉल डी नोवो असेंबली और एआईएस के गतिशील व्यवहार के मात्रात्मक अध्ययन की अनुमति देता है।
अक्षतंश प्रारंभिक खंड सबसे कशेरुकी न्यूरॉन्स में समीपस्थ अक्षांश पर स्थित है। कार्यात्मक रूप से, एआईएस वह जगह है जहां इस क्षेत्र में वोल्टेज-गेटेड सोडियम चैनलों के उच्च घनत्व के कारण कार्रवाई क्षमता शुरू की जाती है। कुछ उत्तेजक न्यूरॉन्स के एआईएस को भी गैबर्जिक सिनेप्स 1 , 2,3बनाने के माध्यम से निरोधात्मक इंटरन्यूरॉन्स द्वारा लक्षित कियाजाताहै । इसलिए, एआईएस सेल सिग्नलिंग को एकीकृत करने और न्यूरॉन्स की उत्तेजना को संशोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण साइट है। एआईएस आम तौर पर लंबाई में 20-60 माइक्रोन है और कोशिका शरीर के 20 माइक्रोन के भीतर स्थित है। एआईएस की लंबाई और स्थिति मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स में भिन्न होती है, साथ ही एक ही न्यूरॉन4,5के विभिन्न विकासात्मक चरणों में भी भिन्न होती है। संचित साक्ष्यों से यह पता चला कि न्यूरोनल गतिविधि 4,5,6,7के परिवर्तन का जवाब देने में एआईएस की संरचना और स्थिति गतिशील है ।
480 केडीए ेंकिरिन-जी एआईएस के मास्टर ऑर्गनाइजर हैं। 480 केडीए एंकिरिन-जी एक झिल्ली से जुड़े एडाप्टर प्रोटीन है जो सीधे वोल्टेज गेटेड सोडियम चैनलों के साथ-साथ बीटा 4-स्पेक्ट्रिन, केसीएनक्यू 2/3 चैनलों सहित अन्य प्रमुख एआईएस प्रोटीन को बांधता है जो सोडियम चैनल गतिविधि8,9और186 केडीए न्यूरोफासिन को मिलाते हैं, एक एल1कैम जो गैबेर्गिक सिंपस को ए2,100को निर्देशित करता है। 480 केडीए एंकिरिन-जी शेयर कम 190 केडीए एंकिरिन-जी आइसोफॉर्म (एएनके रिपीट्स, स्पेक्ट्रिन बाइंडिंग डोमेन, रेग्युलेटरी डोमेन) में पाए जाने वाले कैनोलॉजिकल एंकिरिन डोमेन, लेकिन एक विशालकाय एक्सोन द्वारा प्रतिष्ठित किए जाते हैं जो केवल कशेरुकी में पाया जाता है और विशेष रूप से न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है(चित्रा 1A)11,12। एआईएस गठन12के लिए 480 केडीए एंकिरिन-जी न्यूरॉन विशिष्ट डोमेन (एनएसडी) की आवश्यकता है। 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस असेंबली को बढ़ावा नहीं देता है या एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स12में एआईएस को लक्षित नहीं करता है। हालांकि, 190 केडीए एंकिरिन-जी एआईएस पर केंद्रित है जिसमें 480 केडीए एंकिरिन-जी12है। वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के पूर्व-इकट्ठे एआईएस को लक्षित करने के लिए 1 9 0 केडीए एंकिरिन-जी की यह क्षमता साहित्य में भ्रम का स्रोत रही है और एआईएस असेंबली में 480 केडीए एंकिरिन-जी के महत्वपूर्ण विशेष कार्यों की सराहना धीमी हो गई है। इसलिए, एंकिरिन-जी-नल न्यूरॉन्स में एआईएस असेंबली का अध्ययन करना महत्वपूर्ण है जिसमें पूर्व-इकट्ठे एआईएस की कमी है।
यहां, हम ANK3-E22/23-flox चूहों से सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स का उपयोग करके एआईएस की असेंबली और संरचना का अध्ययन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो एंकिरिन-जी 13(चित्रा 1B)के सभी आइसोफॉर्म को समाप्त करता है। एआईएस के इकट्ठा होने से पहले क्रे-बीएफपी निर्माण के साथ न्यूरॉन्स को ट्रांसफेक्ट करके, हमने एंकिरिन-जी-कमी वाले न्यूरॉन्स को पूरी तरह से एआईएस(चित्रा 1 बी, चित्रा 2)की कमी पैदा की। एआईएस की असेंबली को क्रे-बीएफपी प्लाज्मिड के साथ 480 केडीए एंकिरिन-जी-जीएफपी प्लाज्मिड के सह-ट्रांसफैक्शन के बाद पूरी तरह से बचाया गया है। यह विधि एक गैर-पूर्व-इकट्ठे एआईएस वातावरण में एआईएस असेंबली का अध्ययन करने का एक तरीका प्रदान करती है। हमने एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग किए बिना गैरी बैंकर से ग्लिया-न्यूरॉन सह-संस्कृति प्रणाली को भी संशोधित किया, जो पहले भ्रूणीय दिन 18 न्यूरॉन्स के लिए डिज़ाइन किया गया था, पोस्टनेटल माउस न्यूरॉन्स के लिए आवेदन के लिए और एआईएस14, 15की भिन्नता को सामान्य बनाने के लिए कई न्यूरॉन्स से औसत एआईएस माप के लिए एआईएस क्वांटिटेशन विधि को अनुकूलित किया।
एआईएस की असेंबली का आयोजन 480 केडीए ेंकिरिन-जी द्वारा किया जाता है। हालांकि, एंकिरिन-जी में छोटे आइसोफॉर्म हैं जो वाइल्डटाइप न्यूरॉन्स के एआईएस को लक्षित कर सकते हैं, जिससे एआईएस असेंबली के संरचना-कार्य…
The authors have nothing to disclose.
हम न्यूरोनल कल्चर प्रोटोकॉल पर सुझाव के लिए डॉ गैरी बैंकर को धन्यवाद देते हैं । यह काम हावर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट, एनआईएच से अनुदान, और जॉर्ज बार्थ गेलर संपन्न प्रोफेसरशिप (V.B.) द्वारा समर्थित है।
10xHBSS | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
18mm coverglass (1.5D) | Fisher Scientific | 12-545-84-1D | |
190kDa ankyrin-G-GFP | Addgene | #31059 | |
2.5% Tripsin without phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
480kDa ankyrin-G-GFP | lab made | Provide upon request | |
ANK3-E22/23f/f mice | JAX | Stock No: 029797 | B6.129-Ank3tm2.1Bnt/J; |
B27 serum-free supplement | Thermo Fisher Scientific | A3582801 | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
Cell strainer with 70-mm mesh | BD Biosciences | 352350 | |
Ceramic coverslip-staining rack | Thomas Scientific | 8542E40 | |
Cre-BFP | Addgene | #128174 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
GlutaMAX-I supplement | Thermo Fisher Scientific | A1286001 | |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668030 | |
MEM with Earle’s salts and L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
Nitric acid 70% | Sigma-Aldrich | 225711 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Poly-L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 26124-78-7 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1310-58-3 |