Presentert her er protokollen til Conpokal teknikken, som kombinerer konfokal og atomkraft mikroskopi i en enkelt instrument plattform. Conpokal gir samme celle, samme region, nær samtidig konfokal avbildning og mekanisk karakterisering av levende biologiske prøver.
Teknikker tilgjengelig for mikro- og nano-skala mekanisk karakterisering har eksplodert de siste tiårene. Fra videreutvikling av skanning og overføring elektron mikroskop, til oppfinnelsen av atomkraft mikroskopi, og fremskritt i fluorescerende avbildning, det har vært betydelige gevinster i teknologier som gjør det mulig å studere små materialer. Conpokal er et portmanteau som kombinerer konfokal mikroskopi med atomkraftmikroskopi (AFM), hvor en sonde “pokes” overflaten. Selv om hver teknikk er ekstremt effektiv for kvalitativ og/ eller kvantitativ bildesamling alene, gir Conpokal muligheten til å teste med blandet fluorescensavbildning og mekanisk karakterisering. Conpokal er designet for nær samtidig konfokal avbildning og atomkrafts sondering, og forenkler eksperimentering på levende mikrobiologiske prøver. Den ekstra innsikten fra sammenkobling gir samlokaliseringav målte mekaniske egenskaper ( f.eks.elastisk modulus, vedheft, overflaterushet) av AFM med subcellulære komponenter eller aktivitet som kan observeres gjennom konfokal mikroskopi. Dette arbeidet gir en trinnvis protokoll for drift av laserskanning konfokal og atomkraft mikroskopi, samtidig, for å oppnå samme celle, samme region, konfokal avbildning, og mekanisk karakterisering.
Mikro- eller nanoskala mekaniske evalueringsverktøy brukes ofte til å avdekke deformasjonsegenskapene på enkeltcelle- eller mikroorganismenivå, mens separate høyoppløselige mikroskopiverktøy brukes til å visualisere subcellulære prosesser og strukturelle egenskaper. Conpokal, er kombinasjonen av laserskanning konfokal mikroskopi og atomkraft mikroskopi (AFM) i en enkelt instrumental plattform. Conpokal-teknikken ble først implementert i et ikke-biologisk polymersystem, hvor målet var å bestemme vedheft, elastisitet og overflatespenning av harde overflater i kontakt med myke overflater. Konfokale bilder ga en visuell gjengivelse av hvordan polymeren deformerer, holder seg og frigjør fra den harde sonden1,2. Fra polymerer til biologiske prøver, gir denne teknikken mulighet for nær samtidig levende celle eller mikroorganisme confocal imaging og AFM.
Endringer i celleelastisitet har vært innblandet i patogenesen av mange menneskelige sykdommer3 inkludert vaskulære lidelser4Malaria5,6, sigdcelleanemi7Leddgikt8Astma9, og kreft6,10,11,12,13,14,15. Vanlige teknikker for å måle mekanikken til celler inkluderer bruk av magnetiske perler16,17, optiske pinsett18,19, mikropipette aspirasjon8,20,21,22og AFM11,23,24,25,26. Siden anvendelsen av AFM til levende celler, har det lett blitt tilpasset for å karakterisere celletopografi27,28 samt mekaniske egenskaper11,24,29,30,31 med nanoskala presisjon. AFM er ytterligere tilpasset mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, og krype25,36,37 eksperimenter for å studere viskoelastiske egenskaper av ulike cellelinjer. Bruken av en passende nanokontaktmodell er avgjørende for ekstraksjon av kvantitative elastisitetsverdier fra AFM-produserte kraftinnrykkmålinger1,2. AFM-studier som undersøker påvirkning av cytoskeletale legemidler på celleelastisitet har vist at elastisk modulus er sterkt påvirket38. Basert på de elastiske modulusmålingene har mange forskere vist at kreftceller er mykere enn deres ikke-transformerte kolleger11,38,39. Økt deformabilitet spiller sannsynligvis en fremtredende rolle i kreftcellers evne til å metastasere og infiltrere vev40. Slik oppførsel er regulert av modifikasjoner i cytoskeletal organisering av celler38,41,42. I tillegg til kreft er en annen klasse mekanisk avhengige sykdommer luftveissykdommer. For eksempel påvirker akutt respiratorisk stresssyndrom flere og flere mennesker hvert år. Det har vist seg at når pasienter blir satt på mekanisk ventilasjon, med høye konsentrasjoner av oksygen, kan tilstanden forverres43. I en rekke studier som observerte alveolr epitelmakrofager med AFM, fant forskere at tilsetningen av et oksygenrikt miljø økte stivheten av celler på grunn av aktindannelse; et godt eksempel på virkningen AFM har på vår detaljerte forståelse av atmosfærisk miljøpåvirkning på respiratorisk funksjon på cellenivå og til slutt menneskelig helbredelse og helse44,45,46. Epitelcellestivhet under migrering mot et sår kan også vurderes via AFM, og at det oppstår en variasjon i elastisk modulus for å signalisere fremtidig cellespredning47,48. Derfor er det et praktisk behov for å måle cellemekanikk kvantitativt for å forstå hvordan syke celler skiller seg fra, og samhandler med, sunne.
AFM brukes også til å studere klebende egenskaper og overflatestruktur. Et atomkraftmikroskop har en rekke moduser for å samle inn informasjon om en prøve ved hjelp av kontaktmekanikk. For levende biologiske prøver er to av hovedmålene å oppnåkvantitative mekaniske eiendomsverdier ( f.eks.elastisk moduli, selvklebende krefter) samt kartoverflatehøyde. Disse modusene inkluderer tappemodus (også kjent som intermitterende kontakt), som opprettholder en konstant cantilever amplitude som midlertidig kontakter prøveoverflaten og kontaktmodusen, noe som hever eller senker cantilever for å opprettholde en konstant avbøyning49. Vedheftskart kan samles inn ved hjelp av krafttilordning på AFM-systemet. Cantilever rykker prøven til en viss kraft og trekkes deretter tilbake. Kraften som motstår tilbaketrekking måles av detektoren for å generere en kraftforskyvningsgraf. Vedheftskraften er den maksimale kraften målt under tilbaketrekking. Overflatemorfologi gir en detaljert visning av prøven på mikro- eller nanonivå. Cantilever fullfører en rasterskanning over prøven basert på innrykk og avbøyning fanget av bevegelsen til cantilever på hver piksel, avslører mikro- og nanostørrelsesfunksjoner. Med AFM, størrelsen på små funksjoner som peptidoglykan struktur50, polymer kjedejustering 51, flagella52, lamellipodia53, og filipodia54 kan måles. Mens AFMs kraft ligger i kraftforskyvningskurver og ikke-optiske topologiske bilder, gir konfokal mikroskopi detaljert avbildning av fluorescerende merkede prøver.
Konfokal laserskanning mikroskopi (CLSM) er en dominerende teknikk for avbildning av levende celler, faste celler ogvev 55,56,57. CLSM har vært ansatt for biologisk avbildning siden 1955, det vil vil,siden starten58,59. Mens arbeidsprinsippet for konfokale mikroskoper ( det vil at avvisningen av ut av fokuslys gjennom et pinhole) har forblitt stort sett det samme, har dentekniske implementeringenblitt svært variert56,57,58,60. Konfokal avbildning kan implementeres via flerpunktsskanning, som i et spinnende platesystem61,punktskanning av en enkelt laserstråle, som i linjeskanning62, eller bilde av punktspredningsfunksjonen med påfølgende pikselomfordelinger via en multi-elementdetektor 57. Nylige fremskritt som utvider nytten av konfokal bildebehandling inkluderer laserskanning evne, høyhastighets resonans skanning, og høy følsomhetdetektorer 63,64,65. Fordelen som alle konfokale systemer har over widefield mikroskoper er evnen til å utføre optisk snitting i z-aksen med større detaljer, spesielt i tykke prøver. Widefield-mikroskoper ved hjelp av kamerabasert deteksjon samler lys som slippes ut fra fokalplanet, og samtidig lys slippes ut fra overalt i belysningsbanen. Ved å lukke pinhole, på bekostning av å redusere signalet, kan både aksial og lateral oppløsning økes66. I CLSM er bilder bygget opp piksel for piksel gjennom utslippssignalsamling som en eksitasjonslaser skannes over et x-y synsfelt. Samling av flere x-y-plan langs z-aksen til prøven kan deretter brukes til å rekonstruere den 3-dimensjonale arkitekturentil prøven 57,67. Konfokal mikroskopi i forbindelse med innføringen av fluorescerende proteiner, har revolusjonert vår forståelse av cellebiologi68. For eksempel har det blitt et viktig verktøy i nevrovitenskap69. CLSM brukes regelmessig til å observere ryddet vev, og for å oppnå omfattende bilder av immunfarget hjerne og nevronal nettverksarkitektur70. Dette programmet har resultert i ny innsikt i synaptiske kontakter og kommunikasjon mellom nevroner og glialceller i hjernen71. Fra hjerneceller til vesikler, fluorescerende fargingsprotokoller støtter inspeksjon og fangst av cellefunksjoner via konfokal mikroskopi for fremskritt i terapeutisketeknikker 72,73.
Selv om de er imponerende og allsidige verktøy individuelt, gjør kombinasjonen av konfokal og atomkraftmikroskopi (Conpokal) forskere å unikt korrelere topografiske og mikromekaniske cellulære / vevegenskaper med observasjon av ulike cellulære organeller og deres respektive dynamikk. Paret instrumentering tillater brukere å, i hovedsak, “se” hva de sonderer; en stor fordel over en teknikk alene. Med Conpokal er kraftkartlegging gjennom AFM lagt over på konfokale bilder for å korrelere cellestivhet, vedheft eller morfologi til cytoskeletalstrukturen i prøven, for eksempel. Det overordnede målet med Conpokal-metoden er å gi en plattform for forskere å studere levende prøver på en konsis, effektiv måte, og gi både bilde- og materialeiendomsdata i en enkelt plattform. I dette arbeidet demonstrerer vi driften av Conpokal, inkludert riktig prøvevalg og forberedelse, instrumentoppsett, kantileverkalibrering og gi retningslinjer for vellykket feilsøking. Etter protokollen gir vi representative resultater som inkluderer vellykket bakterier og celleAFM høydekartlegging, bakterier og celle AFM modulus kartlegging, og konfokal avbildning av multi-merkede celler, gjennom samme celle confocal og AFM. Vi avslutter med en diskusjon om Conpokal-prosedyren kritiske trinn, feilsøkingsanbefalinger, teknikkbegrensninger, betydning og fremtidige utsikter for metoden.
Conpokal er en avansert, effektiv teknikk for å samle bilder av høy kvalitet og in situ mekaniske egenskaper av levende biomaterialer i et flytende miljø. Evnen til å samle eksepsjonell morfologi og topografi bilder kombinert med live-sample mekaniske egenskaper strekker seg forbi typiske elektron og lys mikroskopi teknikker. Separat gir et konfokalt mikroskop brightfield, epifluorescence og laserskanning konfokale evner for å oppnå detaljerte fluorescerende bilder av prøver av høy kvalitet. En AFM gir mekanisk karakterisering, men uten hjelpeoptikk blir det vanskelig å navigere prøven. Med de to systemene kombinert, kan en bruker samle både bilder og mekaniske egenskaper av nøyaktig samme celle under eksperimentet, noe som er en stor fordel over to separate instrumenter. Formålet med dette manuskriptet er å informere og veilede brukerne om de omfattende egenskapene til det kombinerte Conpokal-systemet for fremtidens biologi, ingeniørfag og helse. Protokollen innebærer utarbeidelse av instrumenter, kulturmedier, retter, valg av mikroorganismer, AFM-prosedyre, konfokal prosedyre og opprydding. De mest kritiske trinnene for en vellykket live, in-solution, Conpokal økt er prøve immobilisering, judicious tips utvalg, og live flekk utførelse. Diskusjonsseksjonen for dette manuskriptet vil utdype kulturanbefalinger, feilsøkingstips og operasjonelle retningslinjer, og fremtidig arbeid for Conpokal-teknikken. Kulturanbefalinger vil dekke veiledning om prøvekultur, immobilisering og farging. AFM, konfokale og Conpokal tips og retningslinjer vil diskutere tipsvalg og kalibrering, oppløsning, begrensninger og nær samtidig drift. Fremtidig arbeid inkluderer utsiktene og potensialet for potensielle forskningsveier.
Protokollen dekker kultur, sondering og avbildning av både levende celle- og faste bakterieprøver. En utfordring til stede når du utfører AFM i væske stammer fra cantilever bevegelse obstruksjon på grunn av prøvehindring og hydrodynamisk dra. Hvis prøven ikke er godt overholdt underlaget, er det potensial for begroing av cantilever ved deler av prøven som flyter i væsken. I så fall er målinger kompromittert siden de er en antagelse av elastisk etterlevelse og mikromekaniske egenskaper av prøven. HEK-cellene ble ikke behandlet med fikseringsmiddel, men S. mutaner og E. faecalis krever ytterligere immobilisering, lik andre prokaryotiske celler. Bakteriene som ble valgt viste aktiv bevegelse som hindret celleobring og avbildning, derfor var prøvene forsiktige, kjemisk festet for å fremme immobilisering. Det finnes alternativer til kjemisk fiksering, for eksempel filtermembraner som fysisk fanger individuelle celler i porene75.
Tipsvalg er også en kritisk komponent for oppsett og drift av AFM. Når mekaniske egenskaper basert på deformasjon av biomaterialet søkes, må man vurdere cantilever stivhet og materialstivhetskompatibilitet, som er en ikke-triviell oppgave. Hovedmålet er å best matche stivheten av materialet med stivheten til den valgte cantilever. Hvis cantilever er mye mykere enn prøven, vil det bli gjenstand for for mye nedbøyning. Hvis kantileveren er stivere enn prøven, kan det hende at AFM-detektoren ikke kan fange opp slike små nedbøyninger. Det anbefales at når du velger en passende AFM cantilever, å velge basert på eksperimentell anvendelse. For å samle detaljerte bilder i intermitterende kontaktmodus, afm tips innenfor et område på 0,1 – 0,3 N / m for stivhet og spiss radius innen 5 nm – 100 nm er effektive for live celle bildebehandling. Små koniske tips anbefales. Skarpe tips gir et lite kontaktområde og evne til å rykke inn ytterligere ved å samle inn små detaljer og funksjoner i prøvemorfologi76. Skarpe tips kan imidlertid også være problematiske da de er utsatt for punktisering av prøver når innstillingene (f.eks.settpunkt, pikseltid, tilnærmingshastighet) krever for mye innrykk eller innrykket er for raskt. For å unngå høy belastningshastighetseffekter, lokal belastningsherding nær en skarp spiss, eller bare for å kontrollere kontaktområdet og tilnærmingshastigheten, velger mange å bruke kraftspektroskopi med en kolloidal spiss for å måle en elastisk modulus.
AFM-spisser innenfor et område på 0,01 – 1,0 N/m for stivhet og spissradius innen 1 – 5 μm anbefales for å måle den elastiske modulien til levende celler. Store spissstørrelser, vanligvis glasscolloider, gir et kjent kontaktområde og er usannsynlig å punktere cellen mens den er i kontakt. Rektangulære cantilevers foretrekkes fremfor trekantede fordi den kontaktfrie metoden under kalibreringen kan brukes til rektangulær geometri sammenlignet med kontaktbasert kalibrering for trekantede geometrier. Også på grunn av den delikate naturen til AFM-spisser anbefales det at operatøren implementerer pinsett med gummispisser for å redusere potensialet for å skade den delikate AFM-brikken eller monteringsblokken. Andre parametere å huske på inkluderer tilnærmingshastigheten til AFM-spissen og mengden innrykk i prøven. En god retningslinje er å holde innrykk til ca 10% av tykkelsen (eller høyden) av prøven og velge en hastighet som utelukker potensiell hydrodynamisk motstand oppleves av cantilever38.
Intrikate eksperimentelle instrumenter leveres vanligvis med veisperringer som krever feilsøking i instrumentoppsettet, kalibreringen og driften. Krasje AFM tips eller cantilever inn i prøven eller prøve substrat er en vanlig feil for nye brukere. For å unngå dette problemet foreslår protokollen å sikkerhetskopiere cantilever ut 2000 μm. Dette trinnet sikrer at spissen ikke kommer i kontakt med bunnen av parabolen hvis den forrige brukeren glemte å sikkerhetskopiere spissen når du rydder opp etter eksperimentering. 2000 μmavstanden ble imidlertid valgt for den valgte parabolholderen som brukes i denne protokollen. Et annet område, større eller mindre, må kanskje velges avhengig av parabolholderstilen som brukes. Under justeringen av laseren og detektoren nevner protokollen justering av en speilknapp for å maksimere sumsignalet. Det kan hende at det ikke finnes en speiljusteringsknapp på alle AFM-er. Hvis det finnes, er imidlertid en måte å manipulere instrumentet til å feilsøke et lavsumsignal å justere speilknappen, som brukes til å ta hensyn til mediet der skanning vil finne sted; flytende (f.eks.vann, media, PBS) eller luft. På grunn av forskjellen i indeks for brytning for lys gjennom luft og gjennom væske, kan det hende at speilknappen må justeres. Den maksimale bøyefølsomheten til AFM-cantileveren vil være på plasseringen av AFM-spissen, derfor må laserlyset, som returnerer bøyeposisjonen gjennom plasseringen på en fotodiode, være plassert på plasseringen av AFM-spissen. Avhengig av AFM-spissen som er valgt, kan sumsignalverdien variere fra 0,3 – 3,0 V. Et baksidebelegg på AFM-cantilever som Cr-Au eller Al vil øke sumsignalet og følsomheten til målingen.
Spissgeometri er relevant når du fullfører tuppkalibrering under AFM-drift. Det er observert god enighet mellom ikke-kontakt og kontaktkalibrering. Hvis den valgte AFM-cantileveren ikke er rektangulær, må kontaktkalibrering utføres. Husk at mediet der spissen er kalibrert må være det samme som prøvemediet. Hvis disse væskene er forskjellige, må brukeren kalibrere på nytt. Når du bruker AFM-spissene i væske, bør frekvensen målt av systemet være en fjerdedel til en tredjedel av den naturlige resonansfrekvensen som produsenten har. En god måte å kontrollere at systemet kalibrerte spissen riktig er å verifisere verdiene i den termiske støyfilen som genereres. Kontroller at denne filen lagres i riktig mappe. Hvis systemet har problemer med å kalibrere eller ikke-sannsynlige verdier kommer ut, rekalibrere, eller justere laserposisjonen litt deretter rekalibrere.
En annen årsak til dårlig sumsignal kan skyldes AFM cantilever justering. Når AFM-brikken er montert i glassblokken, er det viktig at spissen av cantilever forblir innenfor det lille laservinduet (glatt glassområde). Hvis brikken er for langt frem, kan vinkelen som cantilever naturlig hviler forårsake et problem med refleksjon av cantilever, mangler fotodetector og resulterer i dårlig sumsignal. Hvis brikken er for langt tilbake, laseren vil ikke være i stand til å reflektere av baksiden av cantilever, forårsaker dårlig sum signal. Av disse grunnene kan det hende at den monterte AFM-brikken må justeres. I tillegg oppstår et annet problem som kan oppstå med høyden på prøven. AFM-instrumentet som brukes i denne protokollen har et maksimalt piezo z-område (høyde) på 15 μm. Hvis en bruker finner ut at programvaren ikke kan samle inn høydedata og tvinge kart i en bestemt piksel, vises en svart boks som indikerer at systemet er utenfor rekkevidde (figur 2C). En måte å problemer skyte dette problemet er å sette piezo høyde til en lavere verdi, for eksempel 2 eller 3 μm slik at det meste av 15 μm området er forpliktet til å kartlegge den forventede høyden på cellen. Denne teknikken bør, i de fleste celle- eller bakterierelaterte eksperimenter, løse problemet knyttet til z-området.
Experimentalists som krever en utvidet z-rekkevidde for høye prøver med høyder større enn 10 – 15 μm kan trenge å forfølge en ekstra modul på AFM. AFM-produsenter har dette alternativet tilgjengelig mot et pristillegg for de fleste systemer. Ved å utvide z-serien har eksperimentalisten tilgjengeligheten til å skanne prøver som anses høye i mikroskalaen med små problemer for ute av rekkeviddeverdier eller AFM piezo motormodifisering. Selv om disse modulene koster ekstra, kan noen, avhengig av produsenten, tilby ekstra høyde, opptil 100 μm i z-retningen. Konfokal er fortsatt mulig med høyere prøver hvis brukeren har lang arbeidsavstand, høy forstørrelsesmål eller er villig til å bruke et luftmål, kanskje en 20x eller 40x. Ved å senke mikroskop objektiv forstørrelse, øker arbeidsavstanden, og får avstand til å se toppen av en høyere prøve. Denne endringen til et lavere forstørrelsesmål vil ofre oppløsning. I Conpokal-oppsettet nevnt i dette manuskriptet, har 60x TIRF (total intern refleksjon fluorescens) målet en arbeidsavstand på nær 100 μm forbi dekkslippen på den glassbunnede prøvefatet.
Når det gjelder det konfokale mikroskopet det refereres til i dette manuskriptet, diskuteres noen viktige bestemmelser. Det konfokale systemet som brukes til produksjon av figurene i dette manuskriptet implementerte et 60x TIRF oljemål med en numerisk blenderåpning på 1,49. Laserlinjer ved 405 nm, 488 nm og 561 nm eksitasjonsbølgelengder ble brukt til levende celleprøveavbildning, vist i figur 3 og figur 4. Diffraksjonsgrensen for det confocal mikroskopet kan bestemmes ved hjelp av Abbe Resolution-ligningen, Abbe Resolution (x,y) = λ/2NA, hvor λ er eksitasjonsbølgelengden for Alexa 488, ved 488 nm, og NA er den numeriske blenderåpningen for den konokale kondensatoren, som er 0,3. Derfor bestemmes en aksial oppløsning på 272 nm. For epifluorescence imaging anses to tilfeller å bestemme oppløsningen der pinhole er satt til en luftete enhet (AU) og 0,5 AU. I sistnevnte tilfelle er pinhole stengt ned slik at betydelig lystap oppstår, men oppløsningen øker. Den confocal programvare beregner laterale innfødte og aksiale innfødte oppløsninger ved 170 nm og 290 nm for pinhole på 0,5 AU, og 200 nm og 370 nm for pinhole på 1 AU, henholdsvis. Sfæriske avvik introdusert i systemet kan redegjøres for gjennom en overføringsprosess for å øke kontrasten og oppløsningen i mikroskopbilder. På grunn av diffraksjonsbegrensningene som er iboende med konfokale mikroskoper, mangler det konfokale bildet av bakteriekolonien i figur 6 matchende oppløsning for detaljene sett i AFM-skanningen av bakterier i figur 5. AFM gir tilgang til nanoskalafunksjoner og detaljer som er vanskelige å fange med et konfokalt mikroskop. Men avhengig av den nødvendige fluorescensoppløsningen som trengs, viser figur 5 og figur 6 anvendelsen av Conpokal-teknikken til mikrober i tillegg til eukaryotiske celler.
En fordel med å bruke et konfokalt mikroskop gjør det mulig for operatøren å samle 3D-bilder av bestemte regioner i en prøve med skjerpet detalj. Disse bildene korrelerer med AFM ved å se overflaten som ble undersøkt via AFM-bildet og en konfokal skanning av samme region. Siden mikroskopet er invertert, samler et epifluorescence-bilde lysinformasjon fra motsatt side av prøven som ble undersøkt. Pinhole i konfocal systemet bidrar til å begrense til et enkelt plan fra en viss avstand mens filtrering ut lys som kommer fra resten av prøven eller til og med rommet. I hovedsak bidrar pinhole til å isolere lyset som kommer tilbake fra enkeltplan av interesse for prøven. Vanligvis må dette planet av interesse inneholde sterke fluoroformarkører fordi, for inverterte konfokale systemer, ville enkeltmolekyldeteksjon være begrenset til konfokale mikroskoper med høyere oppløsning. Epifluorescence belysning er mindre ønskelig på grunn av det faktum at i epifluorescence bildebehandling modus, er noe lys fra prøven som gjenspeiles inn i målet samlet inn og brukes til å generere bildet, derfor umulig å isolere et enkelt plan. Confocal teknikker gir et mer isolert enkeltplanbilde av den aktuelle prøvefunksjonen på grunn av pinhole77. Hvis for eksempel toppen av en eukaryotisk celle er undersøkt av AFM, kan den samme overflaten isoleres med laserskanningstrofikale evner av mikroskopet, i stedet for med epifluorescence bildebehandlingsmodus. Det anbefales å overvåke cellenes helse/form under datainnsamling via bildebehandling samtidig i differensialkontrastmodus ved hjelp av den overførte lysdetektoren og 488 nm laserlinjen. Når du fanger en z stabel av prøven, for prosedyren beskrevet ovenfor, bare forsterkning av detektoren er justert. Enhver morfologisk endring i cellene under målingen, som ikke nødvendigvis er synlig i de fluorescerende kanalene, indikerer at artefakter innføres i målingen.
Ideell avstand mellom planene kan oppnås ved å følge programvareanbefalingen for den korteste bølgelengden som brukes i bildeteknikken. Den opprinnelige oppløsningen og signal-til-støy-forholdet i bildevolumene kan effektivt forbedres ved å bruke overføringsalgoritmer som er tilgjengelige i bildebehandlingsmodulen til oppkjøpsprogramvaren. Imidlertid er det viktig å utføre fluorescerende mikroskopi, valg av spesifikke flekker og fargestoffer for å unngå tidlig bleking eller krysstale fra overlappende eksitasjon / utslippspektra. Noen ganger kan en bruker oppleve en funksjonsfeil i konfokal lysgenerering. Hvis en bruker opplever mangel på lysutslipp eller feil laserlinjer, er en måte å feilsøke på å tilbakestille systemet, vanligvis gjort ved å starte operativsystemet på nytt. Hvis problemet vedvarer, kan det hende at den overførte lysdetektoren ikke har klart å bevege seg inn eller ut av sted innenfor den optiske banen til lysmikroskopet. Tilbakestilling av senderdetektorens posisjon kan bidra til å lindre lysoppsamling eller laseravbildningsproblemer.
Fokuset til Conpokal-instrumentet er å gi brukerne muligheten til å samle optisk og kraftbasert informasjon om levende biomaterialer i et flytende miljø, samtidig og på samme celle eller funksjon. Dette arbeidet beskriver eksplisitt hvordan du utfører disse eksperimentene i væske, et naturlig hjem for mange biomaterialer, selv om tørre eksperimenter fortsatt kan utføres ved hjelp av instrumenteringen. Med prøver tilberedt i Petri-retter er parabolhøyden en begrensning. På grunn av konfigurasjonen av glassblokken som holder AFM-cantileveren, må sideveggene på oppvasken være under 10 mm i høyden; Hvis fatet er for høyt, vil ikke instrumentet kunne senke AFM-spissen til overflaten av prøven eller underlaget.
Selv om det er en begrensning for prøvestørrelse, er det ingen begrensning med instrumentet eller programvarefunksjonene med hensyn til en tidsforsinkelse. Samtidig konfokal og AFM er mulig med de riktige faktorene på plass. Begrensningen som bidrar til den nær samtidige evnen refererer til støyen som genereres når du utfører visse konfokale mikroskopifunksjoner og atomkraftmikroskopifunksjoner samtidig. Vibrasjonene fra motorene som beveger mikroskopmålet under innsamling av en z-stabel, vil bli lagt til signalet fra AFM-probespissen under bevegelsen. Støyen vil bli forbedret av et oljemål, da motorene beveger seg opp og ned i z-retningen for å belyse sekvensielle fly i prøven. Derfor inkluderer den anbefalte protokollen sekvensiell samling av AFM-skanninger og confocal z stack-bilder. Samtidig CLSM og AFM ville kreve stasjonær avbildning med konfokal, men med dagens teknikk kan forsinkelsestiden for de to instrumentene være så kort som titalls sekunder. Den faktiske tiden for å bytte fra AFM-operasjon til konfokal bildebehandling var rundt 2 – 4 minutter for bildene samlet inn i figur 2A og figur 4B. Denne verdien ble bestemt ved å trekke de to bildesamlingstidsperiodene fra den totale tiden på 33 minutter, som inkluderer tiden for å starte og fullføre AFM-skanningen, bytte instrumentmoduser for å aktivere konfokal bildebehandling, og begynne og fullføre den konokkale bilde z-stakken.
Fremtiden til Conpokal har som mål å utforske nye struktur-funksjon relasjoner i tillegg til ivrig innsikt i enkeltcelleprosesser. For eksempel vil eksperimentering av in situ-medikamentbehandlinger på celle- eller bakterieprøver for å bestemme effekten av celleelastisitet være et fremskritt for biomaterialer, biologi og biomekanikk. Behandlingsterapi i prøveretten mens avbildning og sondering ville gi kunnskap om hvordan prøven reagerer på terapeutiske midler i et levende og nøye kontrollert miljø, over tid. Innlemme en ny narkotika eller miljøutfordring ville utvide forståelsen av hvordan cytoskeleton eller organelle plassering påvirker bevegelse, topologi, stivhet, etc. En annen potensiell utvikling av Conpokal er evnen til å ha full miljøkontroll av systemet. Den nåværende Conpokal nevnt i denne protokollen er plassert inne i en akustisk kabinett designet for å redusere støy fra innsiden av laboratoriet. Fremme av dette huset ville gi muligheten til å teste innenfor, kanskje, en eller en kombinasjon av faktorer, ikke begrenset til de som et sterilt miljø, temperaturkontrollert, eller variabel-tyngdekraften. Som det står, gir Conpokal-metoden en effektiv og nyttig tilnærming for å karakterisere levende, flytende biomaterialer, men teknikkens fremtid vil bare fremme disse egenskapene ytterligere.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner NIH COBRE-finansiering under nummer P20GM130456. Vi takker UK Light Microscopy Core, som støttes av visepresidenten for forskning, for å få hjelp i dette arbeidet. Stammer av S. mutans og E. faecalis ble levert av Dr. Natalia Korotkova. Den første omtalen av play-on-words, Conpokal, for å beskrive kombinasjonen av konfokal mikroskopi og atomkraftmikroskopi tilskrives Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, ved University of Kentucky, i diskusjon med Dr. Martha Grady (tilsvarende forfatter) i påvente av ankomsten av en seminarspeaker Dr. Jonathan Pham, som sluttet seg til fakultetet i Kjemisk og materialteknikk ved University of Kentucky høsten 2017.
Acoustic Enclosure | JPK-Bruker | Acoustic Enclosure | Chamber used to mitigate noise |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Millipore Sigma | SCT142 | Used to label microtubules in mammalian cells |
CP-qp-CONT-BSG AFM tips | NanoAndMore | CP-qp-CONT-BSG-B | Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples |
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | ThermoFischer Scientific | D282 | Used to label plasma membrane of mammalian cells |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | VWR | VWRL0100-0500 | Component of cell culture media |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285601 | Used to simulate biological environment |
Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 45000-736 | Component of cell culture media |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fischer Scientific | BP1422-500 | Component of bacterial culture medium |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments (WPI) | FD35-100 | Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM |
Hoechst 33342 nucleic acid stain | ThermoFischer Scientific | 62249 | Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC Global Bioresource Center | CRL-1573 | Mammalian cells used in protocol |
Matrigel | VWR | 47743-716 | Coating in cell culture dish |
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips | Bruker | PFQNM-LC-A-CAL | AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells) |
NanoWizard 4a | JPK-Bruker | NanoWizard 4a | AFM |
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | A1 HD25 | Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging |
PENICILLIN/STREPTOMYCIN | VWR | 16777-164 | Component of cell culture media |
PetriDishHeater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Maintains desired Petri dish sample temperature |
qp-BioAC-Cl AFM tips | Nanosensors | qp-BioAC-Cl-10 | Three different AFM cantilevers of varying stiffness |
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers | Ted Pella Inc. | 5051 | Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block |
Todd Hewitt Broth Bacto | BD DIFCO Bacterius Ltd | Bacto-249240 | Component of bacterial culture medium |
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate | Thermo Fisher Scientific | V34850 | Used to fluorescently label bacterial cell wall |