Presenteras här är protokollet i Conpokal tekniken, som kombinerar confocal och atomkraft mikroskopi till ett enda instrument plattform. Conpokal ger samma cell, samma region, nära samtidig konfokal avbildning och mekanisk karakterisering av levande biologiska prover.
Tekniker tillgängliga för mikro- och nanoskala mekanisk karakterisering har exploderat under de senaste decennierna. Från vidareutveckling av skannings- och transmissionselektronmikroskopet, till uppfinningen av atomkraftmikroskopi, och framsteg inom fluorescerande avbildning, har det skett stora vinster inom teknik som möjliggör studier av små material. Conpokal är ett portmanteau som kombinerar konfokalmikroskopi med atomkraftmikroskopi (AFM), där en sond “petar” ytan. Även om varje teknik är extremt effektiv för den kvalitativa och / eller kvantitativa bildsamling på egen hand, conpokal ger möjlighet att testa med blandade fluorescens imaging och mekanisk karakterisering. Conpokal är utformad för nära samtidig konfokal avbildning och atomkraftsutsonering och underlättar experiment på levande mikrobiologiska prover. Den tillsatta insikten från parad instrumentering ger samlokalisering av uppmätta mekaniska egenskaper (t.ex., elastisk modulus, vidhäftning, ytjämnhet) genom AFM med subcellulära komponenter eller aktivitet observerbar genom confocal mikroskopi. Detta arbete ger ett steg för steg protokoll för drift av laserscanning confocal och atomkraft mikroskopi, samtidigt, för att uppnå samma cell, samma region, konfokal avbildning, och mekanisk karakterisering.
Mikro- eller nano-skala mekaniska utvärderingsverktyg används ofta för att avslöja deformationsegenskaperna på encells- eller mikroorganismnivå, medan separata högupplösta mikroskopiverktyg används för att visualisera subcellulära processer och strukturella egenskaper. Conpokal, är kombinationen av laserscanning confocal mikroskopi och atomkraft mikroskopi (AFM) till en enda instrumental plattform. Conpokal-tekniken implementerades först i ett icke-biologiskt polymersystem, där målet var att bestämma vidhäftningen, elasticiteten och ytspänningen hos hårda ytor i kontakt med mjuka ytor. Konfokala bilder gav en visuell återgivning av hur polymeren deformeras, följer och frigörs från den hårda sonden1,2. Från polymerer till biologiska prover, ger denna teknik möjlighet till nära samtidig levande cell eller mikroorganism confocal imaging och AFM.
Förändringar i cellelasticitet har varit inblandad i patogenesen vid många mänskliga sjukdomar3 inklusive vaskulära störningar4Malaria5,6, sicklecellanemi7Artrit8Astma9, och cancer6,10,11,12,13,14,15. Vanliga tekniker för att mäta mekaniken i celler inkluderar användningen av magnetiska pärlor16,17, optisk pincett18,19, mikropipette aspiration8,20,21,22, och AFM11,23,24,25,26. Sedan AFM-tillämpningen på levande celler har den lätt anpassats för att karakterisera celltopografi27,28 samt mekaniska egenskaper11,24,29,30,31 med precision i nanoskala. AFM har anpassats ytterligare för mikrorheologi32,33, frekvensmodulering34,35, och krypning25,36,37 experiment för att studera olika cellinjers viskoelastiska egenskaper. Användningen av en lämplig nanokontaktmodell är avgörande för utvinningen av kvantitativa elasticitetsvärden från AFM-producerade kraftindragsmätningar1,2. AFM-studier som undersöker cytoskeletala läkemedels påverkan på cellelasticiteten har visat att den elastiska modulusen är mycket påverkad38. Baserat på de elastiska modulusmätningarna har många forskare visat att cancerceller är mjukare än sina icke-transformerade motsvarigheter11,38,39. Ökad deformability spelar sannolikt en framträdande roll i förmågan hos cancerceller att metastasera och infiltrera vävnader40. Sådant beteende regleras genom modifieringar i cellernas cytoskeletal organisation38,41,42. Förutom cancer är en annan klass av mekaniska sjukdomar luftvägssjukdomar. Till exempel påverkar akut respiratoriskt stresssyndrom fler och fler människor varje år. Det har visat sig att när patienter sätts på mekanisk ventilation, med höga koncentrationer av syre, deras tillstånd kan förvärras43. I en serie studier observera alveolära epitelial makrofager med AFM, forskarna fann att tillsats av en syrerik miljö ökade styvheten i celler på grund av aktinbildning; ett utmärkt exempel på den inverkan som AFM har på vår detaljerade förståelse av atmosfärisk miljöpåverkan på andningsfunktionen på cellnivå och, i slutändan, människors läkning och hälsa44,45,46. Epitelcellsstelhet vid migration mot ett sår kan också bedömas via AFM och att en variation i elastisk modulus sker för att signalera framtida cellspridning47,48. Därför finns det ett praktiskt behov av att mäta cellmekanik kvantitativt för att förstå hur sjuka celler skiljer sig från, och interagera med, friska.
AFM används också för att studera självhäftande egenskaper och ytstruktur. Ett atomkraftmikroskop har en mängd olika lägen för att samla in information om ett prov med hjälp av kontaktmekanik. För levande biologiska prover är två av de primära målen att erhålla kvantitativa mekaniska egenskapsvärden (t.ex. Dessa lägen inkluderar tappningsläge (även kallat intermittent kontakt), som upprätthåller en konstant cantilever amplitud intermittent kontakta provytan och kontaktläge, som höjer eller sänker cantilever att upprätthålla en konstant avböjning49. Vidhäftningskartor kan samlas in med hjälp av kraftkartläggning på AFM-systemet. Cantilever indragen provet till en viss kraft och sedan dras tillbaka. Kraften motstå upprullning mäts av detektorn för att generera en kraft-förskjutning graf. Vidhäftningskraften är den maximala kraft som mäts vid upprullning. Surface morfologi ger en detaljerad bild av provet på mikro- eller nano-nivå. Den cantilever avslutar en raster scan över provet baserat på indrag och avböjning fångas av rörelsen av cantilever vid varje pixel, avslöjar mikro- och nano-stora funktioner. Med AFM, storleken på små funktioner såsom peptidoglykan struktur50, polymer kedja anpassning51, flagella52, lamellipodia53, och filipodia54 kan mätas. Medan AFM: s makt ligger i kraft-förskjutning kurvor och icke-optiska topologiska bilder, confocal mikroskopi erbjuder detaljerad bildbehandling av fluorescerande märkta prover.
Konfokal laserscanning mikroskopi (CLSM) är en dominerande teknik för avbildning levande celler, fasta celler, och vävnader55,56,57. CLSM har varit anställd för biologisk avbildning sedan1955 dvs , sedan starten58,59. Medan arbetsprincipen för konfokalmikroskop (dvs., förkastandet av out of focus ljus genom ett hål) har förblivit i stort sett densamma, har det tekniska genomförandet blivit mycketvarierande 56,57,58,60. Confocal imaging kan implementeras via multipunktsskanning, som i ett snurrande skivsystem61, punktskanning av en enda laserstråle, som i linjeskanning62, eller bildtagning av punktspridningsfunktionen med efterföljande pixelåterfördelsbyten via en flerelementdetektor57. Senaste framsteg som utökar nyttan av konfokal avbildning inkluderar laserskanning kapacitet, hög hastighet resonansskanning, och hög känslighetdetektorer 63,64,65. Fördelen som alla konfokala system har över widefieldmikroskop är förmågan att utföra optisk snittning i z-axeln med större detaljrikedom, särskilt i tjocka prover. Widefield mikroskop med hjälp av kamerabaserad detektion samla ljus som avges från fokalplanet och samtidigt ljus som avges från överallt i belysningsvägen. Genom att stänga tapphålet, till kostnaden för att minska signalen, kan både den axiella och laterala upplösningen ökas66. I CLSM byggs bilder upp pixel för pixel genom utsläppssignalsamling när en magnetiseringslaser skannas över ett x-y-synfält. Insamling av flera x-y-plan längs z-axeln i provet kan sedan användas för att rekonstruera den 3-dimensionellaarkitekturen av provet 57,67. Konfokalmikroskopi i samband med införandet av fluorescerande proteiner, har revolutionerat vår förståelse av cellbiologi68. Till exempel har det blivit ett viktigt verktyg i neurovetenskap69. CLSM används regelbundet för att observera rensad vävnad, och för att få omfattande bilder av immun färgade hjärnan och neuronal nätverksarkitektur70. Denna ansökan har resulterat i nya insikter i synaptiska kontakter och kommunikation bland nervceller och gliaceller i hjärnan71. Från hjärnceller till vesiklar, fluorescerande färgning protokoll stödja inspektion och avskiljning av cellfunktioner via confocal mikroskopi för framsteg i terapeutiska tekniker72,73.
Även om de är imponerande och mångsidiga verktyg individuellt, kombinationen av confocal och atomkraft mikroskopi (Conpokal) tillåter forskare att unikt korrelera topografiska och mikromekaniska cellulära / vävnad egenskaper med observation av olika cellulära organeller och deras respektive dynamik. Parat instrumentering tillåter användare att, i huvudsak, “se” vad de sonderar; en enorm fördel jämfört med en teknik på egen hand. Med Conpokal, kraft kartläggning genom AFM är överlagrad på confocal bilder att korrelera cellstelhet, vidhäftning, eller morfologi till cytoskeletal struktur inom provet, till exempel. Det övergripande målet med Conpokal-metoden är att tillhandahålla en plattform för forskare att studera levande prover på ett kortfattat, effektivt sätt, vilket ger både bild och materialmaterialmaterialdata i en enda plattform. I detta arbete visar vi driften av Conpokal inklusive korrekt urval och förberedelse av prov, instrumentinställning, cantilever kalibrering, och ge riktlinjer för att lyckas felsökning. Efter protokollet ger vi representativa resultat som inkluderar framgångsrika bakterier och cell AFM höjd kartläggning, bakterier och cell AFM modulus kartläggning och confocal bildbehandling av multi-märkta celler, genom samma-cell confocal och AFM. Vi avslutar med en diskussion om Conpokal proceduren kritiska steg, felsökning rekommendationer, teknik begränsningar, signifikans och framtida utsikterna för metoden.
Conpokal är en avancerad, effektiv teknik för att samla in högkvalitativa bilder och in situ mekaniska egenskaper hos levande biomaterial i en flytande miljö. Möjligheten att samla exceptionella morfologi och topografi bilder i kombination med levande-prov mekaniska egenskaper sträcker sig förbi typiska elektron och ljus mikroskopi tekniker. Separat ger ett konfokalmikroskop brightfield, epifluorescens och laserscanning confocal kapacitet att uppnå högkvalitativa, detaljerade fluorescerande bilder av prover. En AFM ger mekanisk karakterisering, men utan hjälpoptik blir det svårt att navigera i provet. Med de två systemen kombinerade kan en användare samla både bilder och mekaniska egenskaper hos exakt samma cell under experimentet, vilket är en stor fördel jämfört med två separata instrument. Syftet med detta manuskript är att informera och vägleda användare om de omfattande funktionerna i det kombinerade Conpokal-systemet för framtiden för biologi, ingenjörsvetenskap och hälsa. Protokollet innebär beredning av instrument, kultur media, rätter, val av mikroorganismer, AFM förfarande, confocal förfarande, och städa upp. De mest kritiska stegen för en lyckad live, i-lösning, Conpokal session är prov immobilisering, omdömesgilla tips urval, och levande fläck utförande. Diskussionsdelen för detta manuskript kommer att utveckla kulturrekommendationer, felsökningstips och operativa riktlinjer samt framtida arbete för Conpokal-tekniken. Kulturrekommendationer kommer att omfatta vägledning om provkultur, immobilisering och färgning. AFM, confocal, och Conpokal tips och riktlinjer kommer att diskutera tips val och kalibrering, upplösning, begränsningar, och nära samtidig drift. Framtida arbete omfattar utsikterna och potentialen för blivande forskningsvägar.
Protokollet omfattar kultur, sondering och avbildning av både levande cell och fasta bakterieprover. En utmaning närvarande när de utför AFM i flytande stammar från cantilever rörelse obstruktion på grund av prov hinder och hydrodynamic dra. Om provet inte är väl vidhäftat med underlaget finns det potential för påväxt av cantilever genom sektioner av provet som flyter i vätskan. I så fall äventyras mätningar eftersom de är ett antagande av elastisk följsamhet och mikromekaniska egenskaper hos provet. HEK-cellerna behandlades inte med fixativ, men S. mutans och E. faecalis kräver ytterligare immobilisering, liknande andra prokaryota celler. De valda bakterierna visade aktiv rörelse som hindrade cell probing och imaging, därför var proverna försiktigt, kemiskt fast för att främja immobilisering. Det finns alternativ till kemisk fixering, såsom filtermembran som fysiskt fångar enskilda celler i porerna75.
Tipsval är också en kritisk komponent till inställning och drift av AFM. När mekaniska egenskaper baserade på deformation av biomaterialet eftersträvas, måste man överväga cantilever styvhet och material styvhet kompatibilitet, vilket är en icke-trivial uppgift. Det huvudsakliga målet är att bäst matcha materialets styvhet med styvheten hos den valda cantilever. Om cantilever är mycket mjukare än provet, kommer det att bli föremål för för mycket avböjning. Om cantilever är styvare än provet, då AFM detektorn kan vara oförmögen att fånga så små avböjningar. Det rekommenderas att när du väljer en lämplig AFM cantilever, att välja baserat på experimentell tillämpning. För att samla detaljerade bilder i intermittent kontaktläge, AFM tips inom ett intervall på 0,1 – 0,3 N / m för styvhet och spets radie inom 5 nm – 100 nm är effektiva för levande cell avbildning. Små koniska tips rekommenderas. Skarpa tips ger en liten kontaktyta och förmåga att indrag ytterligare medhjälp i att samla in små detaljer och funktioner i prov morfologi76. Men skarpa tips kan också vara problematiska eftersom de är benägna att punktera prover när inställningarna (t.ex. För att undvika hög-stam hastighet effekter, lokala stam härdning nära en skarp spets, eller helt enkelt att kontrollera kontaktområdet och tillvägagångssätt hastighet, många väljer att använda kraft spektroskopi med en kolloidal spets för att mäta en elastisk modulus.
AFM-spetsar inom ett intervall på 0,01 – 1,0 N/m för styvhet och spetsradie inom 1 – 5 μm rekommenderas för att mäta den elastiska moduli av levande celler. Stora spetsstorlekar, typiskt glaskolloider, ger ett känt kontaktområde och kommer sannolikt inte att punktera cellen när de är i kontakt. Rektangulära cantilevers är att föredra framför triangulära eftersom under kalibrering, kan kontaktfri metod användas för rektangulär geometri som jämfört med kontaktbaserad kalibrering för triangulära geometrier. Också, på grund av den känsliga karaktären av AFM tips, rekommenderas att operatören genomför pincett med gummispetsar för att minska risken för att skada den känsliga AFM chip eller montering block. Andra parametrar att tänka på är AFM-spetsens tillvägagångssättshastighet och indragets storlek i provet. En bra riktlinje är att hålla indrag till ca 10% av tjockleken (eller höjden) av provet och välja en hastighet som utesluter potentiella hydrodynamiska motstånd upplevs av den cantilever38.
Intrikata experimentella instrument levereras vanligtvis med vägspärrar som kräver felsökning i det instrument som ställts in, kalibrering och drift. Kraschar AFM spets eller cantilever i provet eller prov substrat är ett vanligt misstag för nya användare. För att undvika detta problem, föreslår protokollet att stödja cantilever ut 2000 μm. Detta steg säkerställer spetsen inte kommer i kontakt med botten av skålen om den tidigare användaren glömde att backa ut spetsen när du städar upp efter experiment. ΜM-sträckan på 2000 μm valdes dock för den valda maträtthållare som används i detta protokoll. Ett annat sortiment, större eller mindre, kan behöva väljas beroende på vilken maträtt innehavare stil som används. Under inriktningen av lasern och detektorn nämner protokollet justering av en spegelvrede för att maximera summasignalen. En spegeljusteringsratten kanske inte finns på alla AMM:er. Om närvarande, dock, ett sätt att manipulera instrumentet för att felsöka en låg summa signal är att justera spegeln ratten, används för att ta hänsyn till det medium där skanning kommer att ske; antingen flytande (t.ex., vatten, media, PBS) eller luft. På grund av skillnaden i index för refraktion för ljus genom luft och genom vätska kan spegelratten behöva justeras. Den maximala böjningskänsligheten hos AFM cantilever kommer att vara på platsen för AFM-spetsen, därför måste laserljuset, som returnerar böjningspositionen genom sin placering på en fotodiod, vara placerad vid platsen för AFM-spetsen. Beroende på vilken AFM-spets som valts kunde summans signalvärde variera från 0,3 – 3,0 V. En baksida beläggning på AFM cantilever såsom Cr-Au eller Al kommer att öka summan signal och känsligheten av mätningen.
Spetsgeometri är relevant när du slutför spetskalibrering under AFM-drift. God överenskommelse har iakttagits mellan beröringsfri och kontaktkalibrering. Om den valda AFM cantilever inte är rektangulär, kontaktkalibrering kommer att behöva utföras. Tänk på att det medium som spetsen är kalibrerad i måste vara samma som provmediet. Om dessa vätskor skiljer sig åt måste användaren kalibrera om. Vid användning av AFM-spetsarna i vätska bör frekvensen som mäts med systemet vara en fjärdedel till en tredjedel av den hos den naturliga resonansfrekvensen som tillverkaren betecknar. Ett bra sätt att kontrollera att systemet kalibrerat spetsen korrekt är att verifiera värden inom den termiska brusfilen som genereras. Se till att den här filen sparar till lämplig mapp. Om systemet har problem med att kalibrera eller icke-sannolika värden kommer ut, kalibrera om, eller justera laserpositionen något sedan kalibrera om.
En annan orsak till dålig summa signal kan bero på AFM cantilever anpassning. När AFM-chipet monteras i glasblocket är det väsentligt att spetsen på cantilever förblir inom det lilla laserfönstret (slät glasområde). Om chipet är för långt fram, vinkeln vid vilken cantilever naturligt vilar kan orsaka ett problem med reflektion av cantilever, saknas fotodetector och resulterar i dålig summa signal. Om chipet är för långt tillbaka, kommer lasern inte att kunna reflektera bort baksidan av cantilever, vilket orsakar dålig summa signal. Av dessa skäl kan det monterade AFM-chipet behöva justeras. Dessutom uppstår ett annat problem som kan påträffas med höjden på provet. AFM-instrumentet som används i detta protokoll har ett maximalt piezo z-intervall (höjd) på 15 μm. Om en användare finner att programvaran inte kan samla in höjddata och tvinga kartor i en viss pixel, kommer en svart ruta att visas som visar att systemet är utom räckhåll (Bild 2C). Ett sätt att besvära skjuta denna fråga är att ställa piezo höjd till ett lägre värde, såsom 2 eller 3 μm så de flesta av de 15 μm området har åtagit sig att kartlägga den förväntade höjden på cellen. Denna teknik bör, i de flesta cell- eller bakterierelaterade experiment, åtgärda problemet i samband med z-området.
Experimentalister som kräver ett utökat z-område för höga prover med höjder större än 10 – 15 μm kan behöva fullfölja ytterligare en modul på AFM. AFM tillverkare har detta alternativ tillgängligt till ytterligare kostnader för de flesta system. Genom att utöka z-sortimentet har experimentalisten tillgång att skanna prover som anses höga i mikroskalan med få problem för utom intervallet värden eller AFM piezo motor modifiering. Även om dessa moduler kostar extra, kan vissa, beroende på tillverkaren, erbjuda ytterligare höjd, upp till 100 μm i z-riktningen. Confocal är fortfarande möjligt med högre prover om användaren har en lång arbetsavstånd, hög förstoring mål eller är villig att använda en luft mål, kanske en 20x eller 40x. Genom att sänka mikroskop objektiv förstoring, arbetsavståndet ökar, få avstånd för att visa toppen av ett högre prov. Denna ändring till en lägre förstoring objektiv kommer att offra upplösning. I Conpokal setup som avses i detta manuskript, 60x TIRF (total intern reflektion fluorescens) mål har ett arbetsavstånd på nära 100 μm förbi täckskydd av glasbottnad prov skålen.
När det gäller det konfokalmikroskop som avses i detta manuskript diskuteras några viktiga bestämmelser. Det konfokala system som används för framställning av siffrorna i detta manuskript genomfört en 60x TIRF oljemål med en numerisk bländare på 1,49. Laserlinjer vid 405 nm, 488 nm och 561 nm excitationsvåglängder användes för levande cellprovavbildning, som visas i figur 3 och figur 4. Konfokalmikroskopets diffraktionsgräns kan fastställas genom att använda Abbe Resolution-ekvationen, Abbe Resolution(x,y) = λ/2NA, där λ är excitationsvåglängden för Alexa 488, vid 488 nm, och NA är den numeriska bländaren för konfokalkondensorn, som är 0,3. Därför bestäms en axiell upplösning på 272 nm. För epifluorescensavbildning anses två fall bestämma den upplösning där pinhole är inställd på en luftig enhet (AU) och 0,5 AU. I det senare fallet stängs pinhålet ner så att betydande ljusförlust uppstår, men upplösningen ökar. Konfokalprogramvaran beräknar laterala infödda och axiella infödda upplösningar vid 170 nm och 290 nm för pinhålet vid 0,5 AU, respektive 200 nm och 370 nm för pinhålet vid 1 AU. Sfäriska aberrationer som introduceras i systemet kan redovisas genom en deconvolution process för att öka kontrast och upplösning i mikroskop bilder. På grund av de diffraktionsbegränsningar som är inneboende med konfokalmikroskop saknar den konfokala bilden av bakteriekolonin i figur 6 den matchande upplösningen för den detalj som ses i AFM-skanningen av bakterier i figur 5. AFM ger tillgång till nanoskala funktioner och detaljer som är svåra att fånga med en confocal mikroskop. Beroende på den fluorescensupplösning som krävs visar dock figur 5 och figur 6 conpokal-teknikens tillämplighet på mikrober utöver eukaryota celler.
En fördel med att använda ett konfokalmikroskop gör det möjligt för operatören att samla in 3D-bilder av specifika regioner i ett prov med vässad detalj. Dessa bilder korrelerar med AFM genom att visa ytan som var probed via AFM bilden och en confocal skanning av samma region. Eftersom mikroskopet är inverterat, samlar en epifluorescensbild in ljusinformation från den motsatta sidan av provet som var sonderade. Pinhole inom confocal systemet hjälper begränsa till ett enda plan från ett visst avstånd samtidigt filtrera ut ljus som kommer från resten av provet eller ens rummet. I huvudsak hjälper pinhole isolera ljuset som kommer tillbaka från det enda planet av intresse i provet. Typiskt, detta plan av intresse måste innehålla starka fluorophore markörer eftersom, för inverterade confocal system, enda molekyl upptäckt skulle begränsas till högre upplösning confocal mikroskop. Epifluorescens belysning är mindre önskvärt på grund av det faktum att i epifluorescens imaging mode, alla ljus från provet som reflekteras in i målet samlas in och används för att generera bilden, därför omöjligt att isolera ett enda plan. Konfokala tekniker ger en mer isolerad enda plan bild av provet funktionen i fråga på grund av pinhole77. Om till exempel apex av en eukaryota cell är probed av AFM, samma yta kan isoleras med laserskanning confocal kapacitet mikroskopet, snarare än med epifluorescens imaging mode. Det rekommenderas att övervaka cellernas hälsa/form under datainhämtning via avbildning samtidigt i differensstörningskontrastläge med hjälp av den överförda ljusdetektorn och 488 nm laserlinjen. Vid fångning av en z-stack av provet, för det förfarande som beskrivs ovan, justeras endast detektorns vinst. Varje morfologisk förändring i cellerna under mätningen, som inte nödvändigtvis syns i de fluorescerande kanalerna, indikerar att artefakter införs i mätningen.
Idealiska avstånd mellan plan kan erhållas genom att följa programvarans rekommendation för den kortaste våglängd som används i avbildningstekniken. Den inhemska upplösningen och signalen till brus förhållandet i bilden volymerna kan effektivt förbättras genom att anställa deconvolution algoritmer som finns i bildbehandling modulen av förvärvet programvara. Men utför fluorescerande mikroskopi, urval av specifika fläckar och färgämnen är avgörande för att undvika tidig on-set blekning eller överhörning från överlappande excitation / utsläpp spektra. Ibland kan en användare uppleva ett fel i confocal ljus generation. Om en användare upplever brist på ljusemission eller felaktig laserlinjer, är ett sätt att felsöka att återställa systemet, vanligtvis gjort genom att starta om programvaran för drift. Om problemet kvarstår kan den överförda ljusdetektorn ha misslyckats med att flytta in i eller på sin plats inom ljusmikroskopets optiska väg. Återställa positionen för sändardetektorn kan bidra till att lindra ljusinsamling eller laseravbildningsproblem.
Conpokal-instrumentets fokus är att ge användarna möjlighet att samla in optisk och kraftbaserad information om levande biomaterial i en flytande miljö, samtidigt och på samma cell eller funktion. Detta arbete beskriver uttryckligen hur man utför dessa experiment i vätska, ett naturligt hem för många biomaterial, även om, torra experiment kan fortfarande utföras med hjälp av instrumenteringen. Med prover som tillagas i petriskålar är maträtthöjden en begränsning. På grund av konfigurationen av glasblocket som håller AFM cantilever, måste de sidoväggar av disken vara under 10 mm i höjd; om rätten är för hög kommer instrumentet inte att kunna sänka AFM-spetsen till provets eller substratets yta.
Även om det finns en begränsning för provstorlek, finns det ingen begränsning med instrumentet eller programvara kapacitet med avseende på en tidsfördröjning. Samtidig konfokal och AFM är möjligt med rätt faktorer på plats. Begränsningen som bidrar till dess nära samtidiga förmåga avser det buller som genereras när du utför vissa konfokala mikroskopifunktioner och atomkraftmikroskopifunktioner samtidigt. Vibrationerna från de motorer som flyttar mikroskopmålet under insamling av en z-stack kommer att läggas till signalen från AFM-sondspetsen under dess rörelse. Bullret kommer att förstärkas genom ett oljemål, eftersom motorerna rör sig upp och ner i z-riktningen för att belysa sekventiella plan i provet. Därför innehåller det rekommenderade protokollet sekventiell samling afm-skanningar och confocal z stack bilder. Samtidig CLSM och AFM skulle kräva stationär bildbehandling med confocal, men med den nuvarande tekniken, fördröjningstiden för de två instrumenten kan vara så kort som tiotals sekunder. Den faktiska tiden för att byta från AFM-drift till konfokal avbildning var runt 2 – 4 minuter för bilderna som samlats in i figur 2A och figur 4B. Detta värde bestämdes genom att subtrahera de två tidsperioderna för bildinsamling från den totala tiden på 33 minuter, vilket inkluderar tiden för att börja och slutföra AFM-skanningen, växelinstrumentlägen för att aktivera konfokal avbildning och börja och slutföra konfokalbilden z-stacken.
Framtiden för Conpokal syftar till att utforska nya struktur-funktion relationer förutom angelägen insikt i encelliga processer. Till exempel, experiment av in situ läkemedelsbehandlingar på cell-eller bakterieprover för att bestämma effekterna av cellelasticitet skulle vara ett framsteg till områdena biomaterial, biologi och biomekanik. Behandling terapi i provet skålen medan imaging och sondering skulle ge kunskap om hur provet svarar på therapeutics i en levande och noggrant kontrollerad miljö, över tiden. Att införliva en ny drog- eller miljöutmaning skulle bredda förståelsen för hur cytoskelettet eller organellens plats påverkar förflyttning, topologi, styvhet etc. En annan potentiell avancemang av Conpokal är möjligheten att ha fullständig miljökontroll av systemet. Den nuvarande Conpokal som nämns i detta protokoll är inrymt inuti en akustisk kapsling utformad för att minska buller från insidan av laboratoriet. Avancemang av detta hölje skulle ge möjlighet att testa inom, kanske, en eller en kombination av faktorer, inte begränsat till sådana som en steril miljö, temperaturkontrollerad, eller ens variabel-gravitation. Som det ser ut, conpokal metoden ger ett effektivt och användbart tillvägagångssätt för att karakterisera levande, i-flytande biomaterial, men framtiden för tekniken kommer bara att föra dessa möjligheter vidare.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner NIH COBRE finansiering under nummer P20GM130456. Vi tackar Storbritannien Light Microscopy Core, som stöds av Vice President for Research, för hjälp i detta arbete. Stammar av S. mutans och E. faecalis tillhandahölls av Dr Natalia Korotkova. Det första omnämnandet av play-on-words, Conpokal, för att beskriva kombinationen av konfokalmikroskopi och atomkraftmikroskopi tillskrivs Dr. Brad Berron, Chemical and Materials Engineering, vid University of Kentucky, i diskussion med Dr. Martha Grady (motsvarande författare) i väntan på ankomsten av en seminarietalare Dr. Jonathan Pham, som gick med i fakulteten i kemi- och materialteknik vid University of Kentucky hösten 2017.
Acoustic Enclosure | JPK-Bruker | Acoustic Enclosure | Chamber used to mitigate noise |
BioTracker 488 Green Microtubule Cytoskeleton Dye | Millipore Sigma | SCT142 | Used to label microtubules in mammalian cells |
CP-qp-CONT-BSG AFM tips | NanoAndMore | CP-qp-CONT-BSG-B | Collodial AFM tips good for modulus measurements on biological samples |
Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) | ThermoFischer Scientific | D282 | Used to label plasma membrane of mammalian cells |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | VWR | VWRL0100-0500 | Component of cell culture media |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | A1285601 | Used to simulate biological environment |
Fetal Bovine Serum | Fischer Scientific | 45000-736 | Component of cell culture media |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fischer Scientific | BP1422-500 | Component of bacterial culture medium |
FluoroDish Cell Culture Dish | World Precision Instruments (WPI) | FD35-100 | Glass-bottomed dishes whose side walls are less than 10 mm, necessary for full function of Nanowizard 4a AFM |
Hoechst 33342 nucleic acid stain | ThermoFischer Scientific | 62249 | Used to label nucleus of mammalian cells, a good nuclear marker for live cells |
Human embryonic kidney 293 cells | ATCC Global Bioresource Center | CRL-1573 | Mammalian cells used in protocol |
Matrigel | VWR | 47743-716 | Coating in cell culture dish |
Model: PFQNM-LC-A-CAL AFM tips | Bruker | PFQNM-LC-A-CAL | AFM tips that work well for samples that have large heights (such as eukaryotic cells) |
NanoWizard 4a | JPK-Bruker | NanoWizard 4a | AFM |
Nikon A1 Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | A1 HD25 | Microscope used for brightfield, epi-fluorescence, and confocal imaging |
PENICILLIN/STREPTOMYCIN | VWR | 16777-164 | Component of cell culture media |
PetriDishHeater | JPK-Bruker | PetriDishHeater | Maintains desired Petri dish sample temperature |
qp-BioAC-Cl AFM tips | Nanosensors | qp-BioAC-Cl-10 | Three different AFM cantilevers of varying stiffness |
Replaceable Carbon Fiber Tip Tweezers | Ted Pella Inc. | 5051 | Used to carefully place and remove delicate AFM tips into the glass mounting block |
Todd Hewitt Broth Bacto | BD DIFCO Bacterius Ltd | Bacto-249240 | Component of bacterial culture medium |
Vancomycin, BODIPY FL Conjugate | Thermo Fisher Scientific | V34850 | Used to fluorescently label bacterial cell wall |