Точное картирование мозга для выполнения повторяющихся In Vivo Изображения нейро-иммунной динамики у мышей
Summary
Этот протокол описывает хронический метод имплантации окна черепа, которые могут быть использованы для продольной визуализации нейроглио-сосудистых структур, взаимодействий и функции как в здоровых, так и в больных условиях. Он служит дополнительной альтернативой транскраниальному подходу к визуализации, который, хотя и часто предпочтительнее, обладает некоторыми критическими ограничениями.
Abstract
Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием нейронных, глиальных, стромальных и сосудистых клеток, которые облегчают его надлежащую функцию. Хотя изучение этих клеток в изоляции in vitro или вместе ex vivo предоставляет полезную физиологическую информацию; в таких контекстах будут упущены основные особенности физиологии нервных клеток. Поэтому необходимо изучать нервные клетки в их родной среде in vivo. Протокол подробно здесь описывает повторяющиеся vivo двух-фотон изображения нервных клеток в коре грызунов в качестве инструмента для визуализации и изучения конкретных клеток в течение длительных периодов времени от часов до нескольких месяцев. Мы подробно описываем использование чрезвычайно стабильного сосуда мозга как грубой карты или флуоресцентно помеченных дендритов как тонкая карта избранных областей мозга, представляющих интерес. Используя эти карты в качестве визуального ключа, мы показываем, как нервные клетки могут быть точно перемещены для последующего повторяющихся изображений in vivo. Используя примеры in vivo изображений флуоресцентно-маркированных микроглии, нейронов и NG2– клеток, этот протокол демонстрирует способность этой техники, чтобы повторяющиеся визуализации клеточной динамики в том же месте мозга в течение длительных периодов времени, что может еще больше помочь в понимании структурных и функциональных реакций этих клеток в нормальной физиологии или после патологических оскорблений. При необходимости такой подход может быть связан с функциональной визуализацией нервных клеток, например, с визуализацией кальция. Этот подход является особенно мощным методом визуализации физического взаимодействия между различными типами клеток ЦНС in vivo, когда генетические модели мыши или конкретные красители с различными флуоресцентными тегами для обозначения клеток, представляющих интерес, доступны.
Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) регулируется сложным взаимодействием взаимодействий между различными типами клеток-резидентов, включая нейроны, глию и клетки, связанные с сосудами. Традиционно, нервные клетки были изучены в изолированных, совместно культивируется1,2,3,4,,5 (in vitro) или вырезанной ткани мозга (ex vivo)6,7,8,9,10 контекстов.4 Тем не менее, необходимо дальнейшее понимание поведения нейронных клеток и взаимодействий в родной среде нетронутыми мозга in vivo. В этом протоколе мы описываем метод картирования регионов, представляющих интерес in vivo, и точно переохотвердем эти регионы в будущих сеансах визуализации для отслеживания сложных взаимодействий между различными типами клеток ЦНС в течение длительных периодов времени.
Развитие подходов к визуализации in vivo дало значительные выгоды для правильного понимания нервной функции11,,12,,13,,14,,15. В частности, эти подходы дают ряд преимуществ по сравнению с традиционными подходами in vitro и ex vivo. Во-первых, в vivo системы визуализации имеют физиологически соответствующие компоненты клеток и тканей, такие как сосуды с полным репертуаром клеточных взаимодействий, чтобы обеспечить полное понимание физиологии нейронной сети. Во-вторых, последние результаты показывают, что при удалении из их родной среды, некоторые нервные клетки (например, микроглии) теряют важные особенности их идентичности и, таким образом, физиологии16,17, которые могут быть сохранены в in vivo настройки. В-третьих, in vivo системы визуализации предоставляют возможность для стабильных продольных исследований от нескольких недель до нескольких месяцев для изучения ЦНС клеточного взаимодействия. Наконец, учитывая растущие данные о вкладах от периферической иммунной системы18,19 и микробиома20,21 в физиологии ЦНС, in vivo системы обеспечивают платформу для допроса таких вкладов и воздействия на клетки ЦНС. Таким образом, подходы, которые используют продольные in vivo изображения для изучения нейро-иммунной физиологии и взаимодействия в здоровых, раненых и больных состояний являются большим дополнением к традиционным подходам.
В этом протоколе мы описываем надежный подход к изображению различных типов клеток в головном мозге, включая микроглии, нейроны и клетки NG2в качестве примеров. Разработаны два подхода к визуализации нервных клеток in vivo: истонченный подход черепа и открытый череп с подходом к черепному окну. Хотя разбавленный череп подходы используются и предпочтительнее, потому что они преодолевают некоторые из недостатков открытого подхода черепа, таких как активация глиальных клеток, выше, чем физиологическая динамика позвоночника и использование противовоспалительных агентов22,23,24,,25, разбавленный череп подходы также показывают несколько критических недостатков. Во-первых, процедура истончения является очень деликатной процедурой, которую многие исследователи трудно усовершенствовать, особенно когда необходимо повторное утончение. Это так, потому что часто трудно для экспериментаторов, чтобы убедиться, что они истончили череп до глубины 20 мкм. Во-вторых, для адекватных сравнений между мышами, истончение должно быть идентичным и различные истончение успеха между изображений сессий или мышей может осложнить визуализацию нервных структур. В-третьих, при использовании для продольной визуализации, животные с истонченными черепами могут быть использованы только для ограниченного числа сеансов при повторном разжижении черепа. В-четвертых, так как некоторые из костной ткани все еще остается, ясность в глубине изображения может быть скомпрометирована от истонченного подхода черепа позволяет большой визуализации более поверхностным, но не так много с более глубокими регионами. В свете этого, более глубокие структуры мозга, такие как гиппокамп, не могут быть успешно изображены с истонченным подходом черепа. Эти соображения высовы воспитывают необходимость в альтернативных и взаимодополняющих подходах, которые могли бы преодолеть эти озабоченности.
Альтернатива истонченным подходом черепа, открытый подход к имплантации окна черепа использует процедуру, в которой череп заменяется оптически ясным стеклом. Это позволяет почти неограниченное количество сеансов визуализации. Кроме того, при замене черепа на стекло крышки, этот метод позволяет четкое окно просмотра флуоресцентно помечены клетки мозга в течение длительных периодов от нескольких часов до месяцев и, следовательно, могут быть использованы для изучения активности клеток и взаимодействий, которые имеют отношение к физиологии, старения и патологии.
В целом, мы подробно шаги, которые могут следовать, чтобы сделать имплантат хронических черепных окон через стереотаксисную краниотомию, что позволяет in vivo изображения областей мозга, представляющих интерес. Мы также описываем, как чрезвычайно стабильная сосуды мозга или флуоресцентно помеченные дендриты могут быть использованы для создания грубой или тонкой карты, соответственно, областей мозга, представляющих интерес. Этот подход может быть использован для повторного изображения в течение нескольких сессий. Важность этого метода, таким образом, заключается в его способности образ долгосрочных изменений или застой в элементах мозга, включая расположение, морфология, и взаимодействия различных клеточных типов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Появление in vivo двух-фотон изображений открыл возможности для изучения множества клеточных взаимодействий и динамики, которые происходят в здоровом мозге. Первоначальные исследования сосредоточены на использовании открытого черепа краниотомии подход к изображению нейрональных денд…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим сотрудников лаборатории Eyo за обсуждение идей, представленных в этой рукописи. Мы благодарим д-ра Джастина Rustenhoven из лаборатории Кипнис в Университете Вирджинии за подарок NG2DsRed мышей33. Эта работа поддерживается за счет финансирования из Национального института неврологических расстройств и инсульта Национального института здравоохранения в U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
