Målet med denne protokol er at anvende en optimeret væv dissociation protokol til en mus model af rygmarvsskader og validere tilgangen til enkelt celle analyse ved flow cytometry.
Vi beskriver implementeringen af rygmarvsskade hos mus for at fremkalde detrusor-sphincter dyssynergi, en funktionel blæreudtagsobstruktion og efterfølgende blærevægombygning. For at lette vurderingen af blærevæggens cellulære sammensætning i ikke-skadede kontrol- og rygmarvsskadede mus udviklede vi en optimeret dissociationsprotokol, der understøtter høj cellegabilitet og gør det muligt at detektere diskrete delpopulationer ved flowcytometri.
Rygmarvsskade er skabt ved fuldstændig transsektion af bryst rygmarven. På tidspunktet for vævshøsten perfunderes dyret med fosfatbufferet saltvand under dyb anæstesi, og blærer høstes i Tyrodes buffer. Væv hakkes før inkubation i fordøjelsesbuffer, der er optimeret baseret på kollagenindholdet i museblæren som bestemt ved forhør af offentligt tilgængelige genekspressionsdatabaser. Efter generering af en enkelt celleaffjedring analyseres materialet ved flowcytometri til vurdering af celle levedygtighed, cellenummer og specifikke delpopulationer. Vi viser, at metoden giver cellepopulationer med større end 90% levedygtighed og robust repræsentation af celler af mesenchymal og epiteloprindelse. Denne metode vil muliggøre nøjagtig downstream-analyse af diskrete celletyper i museblæren og potentielt andre organer.
Perturbationer af normal urinblærefunktion kan føre til nedsat livskvalitet for mange individer. For at få en bedre forståelse af, hvordan skade eller sygdom afsporer normal blærefunktion, er det vigtigt at undersøge den normale biologiske tilstand af celler i blæren, og hvordan de ændrer sig under eksperimentel forstyrrer. Til dato er de specifikke cellepopulationer, der bor i urinblæren, og hvordan de ændrer sig med skade, imidlertid blevet ufuldstændigt karakteriseret.
Enkeltcelleprofileringsmetoder såsom flowcytometri eller enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq) har potentiale til at kaste lys over specifikke celletyper i blæren. For at disse metoder kan være informativt væv, skal de dog fordøjes på en måde, der ikke påvirker levedygtigheden, genekspressionen og repræsentative cellepopulationprocenter af det høstede væv. Protokoller, der anvender enzymatisk opdeling, kan påvirke overflademarkørudtryk gennem vilkårlig proteaseaktivitet1, hvilket påvirker celleidentifikationen ved flowcytometri, mens dissociationsprocessen selv kan føre til induktion af umiddelbare tidlige gener, som beskrevet for nylig af Van den Brink og kolleger2. Forfatterne viste, at selv om den dissociationsramte delpopulation var lille, kunne det udløse et stærkt forurenende signal i bulkudtryksundersøgelser på grund af de høje ekspressionsniveauer for umiddelbare tidlige gener. Desuden påvirkede varigheden af dissociationsprotokollen påviste bulkudtryksniveauer af gener, der viste sig at være unikke for nogle delpopulationer. Således kan enkeltcelledatasæt, der genereres uden at tage højde for virkningen af dissociationsprotokollen, give genekspressionsændringer som følge af dissociationsmetoden i modsætning til underliggende biologi. Disse observationer tyder på, at offentliggjorte enkeltcellede transskriptionsdata skal fortolkes med forsigtighed, og at resultaterne skal valideres ved hjælp af uafhængige metoder.
Selv om barske og langvarige dissociationsmetoder kan ændre genekspression i celler2; effektiv isolering af celler er afgørende for at opnå nøjagtig repræsentation af de tilstedeværende celletyper. Da blæren er et komplekst organ bestående af flere celletyper, kan nogle populationer såsom urotelceller eller stromale celler være relativt underrepræsenteret, mens andre celletyper såsom fibroblaster findes inden for ekstracellulær matrix og kan være udfordrende at isolere. Dissociation bliver endnu mereudfordrende,hvis blæren har gennemgået en betydelig ombygning og fibrose som den , der observeres i rygmarvsskade3,4 eller blæreudtag obstruktion5,6.
Her beskriver vi en optimeret vævsafkoblingsmetode til downstream-enkeltcelleanalyse i rygmarvsskadet museblære. Ved hjælp af flowcytometri sammenlignede vi fire enzymatiske fordøjelsesprotokoller for deres evne til at give en enkelt celleaffjedring, understøtte celle levedygtighed og opretholde den korrekte andel af cellepopulationer. Baseret på denne analyse konkluderer vi, at minimering af celledød, cellulære aggregater, ikke-cellulære nukleinsyrer og potentielle hæmmere af downstream-analyse er afgørende for at opnå data af høj kvalitet.
Musen rygmarv skade model beskrevet her giver en reproducerbar metode til at skabe en funktionel blære stikkontakt obstruktion på grund af tab af koordinering mellem blære sammentrækning og eksterne urethral lukkemuskel afslapning. Dette fremkalder igen dyb ombygning af blærevæggen så tidligt som 2 uger efter skade karakteriseret ved udvidelse af urotel og glatte muskelrum. Kritiske trin i gennemførelsen af SCI-modellen hos gnavere omfatter (i) streng opmærksomhed på manuel blæreudtryk i den periode med spinalchok, der følger i 10\u201214 dage efter skade; ii) ernæringsmæssig berigelse for at minimere vægttab og (iii) afbødning af potentialet for urinskolldning, især for forsøg, der strækker sig ud over tilbagevenden af refleks annullering. Begrænsninger af modellen omfatter potentialet for urethral okklusion hos mus fra blodpropper i perioden med forbigående hæmaturi, og derudover hos hanmus fra sædkoagulum efter retrograd ejakulation efter operationen.
Den her beskrevne vævsafkoblingsmetode illustrerer vigtigheden af at overveje strukturelle ændringer i væv, der opstår som følge af den eksperimentelle fornærmelse, i dette tilfælde betydelig vævsremodellering efter SCI, der kan påvirke downstream-analyser. Med stigningen i enkeltcelleanalyser er det afgørende at sikre, at forskelle observeret i genekspression ikke blot er et resultat af dissociationsinducerede perturbationer, men virkelig er repræsentative for underliggende biologiske ændringer, der er relevante for sygdomsmodellen. Brugen af offentligt tilgængelige udtryksdata gjorde det muligt for os at ændre formuleringen af fordøjelsesbuffere for at sikre effektiv fordøjelse af ekstracellulær matrix og samtidig maksimere levedygtigheden. Yderligere ændringer, der kan overvejes i fremtidige applikationer, omfatter tilføjelsen af actinomycin D for at stoppe transskription af umiddelbare tidlige gener, der er følsomme over for dissociationsprotokol15.
Pipetting teknik er afgørende, når dissociating væv eller overføre celler, der allerede er i suspension. For at reducere fysisk skade på celler fra klipningskræfter er det vigtigt at pipette forsigtigt og langsomt under cellerepension. Det anbefales generelt at bruge bredborede pipettespidser. Hvis du bruger standard tips, er det især vigtigt at pipette celle suspensioner forsigtigt for at undgå forskydning kræfter, der ellers ville skade celler. Brug af cellestammer er uundgåelig i denne protokol, men cellekoncentrationen kan falde med 20% eller mere, ledsaget af et volumentab på 100 μL eller mere. Vi anbefaler, at cellekoncentrationen bestemmes efter belastning for at sikre et præcist celleantal.
I flowcytometri giver FMO-kontroller et mål for baggrund på grund af gennemblødning af signal fra overlappende emissionstoppe. De er ikke et mål for uspecifik antistofbinding eller baggrundspletter, der kan være til stede, når et antistof er inkluderet i den pågældende kanal. For at tage højde for den uspecifikke antistofbinding skal man medtage passende isotypekontroller. til baggrundsplejning, skal man medtage negative kontroller. Tilsammen sikrer disse kontroller nøjagtig måling af cellepopulationer.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Sundhedsinstitutterne (R01 DK077195 til R.M.A, R01 DK104641 til R.M.A og D.R.B). Vi anerkender værdifulde input fra Dr. Stuart Orkin i Division of Hematology / Oncology, Boston Children’s Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School og Dana-Farber Cancer Institute. Vi anerkender også støtte fra Kyle Costa i postoperativ pleje af mus, Mary Taglienti og Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) for teknisk bistand og nyttige diskussioner.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |