En enkelt celle dissociation tilgang til molekylær analyse af urinblæren i musen efter rygmarvsskade

Summary

Målet med denne protokol er at anvende en optimeret væv dissociation protokol til en mus model af rygmarvsskader og validere tilgangen til enkelt celle analyse ved flow cytometry.

Abstract

Vi beskriver implementeringen af rygmarvsskade hos mus for at fremkalde detrusor-sphincter dyssynergi, en funktionel blæreudtagsobstruktion og efterfølgende blærevægombygning. For at lette vurderingen af blærevæggens cellulære sammensætning i ikke-skadede kontrol- og rygmarvsskadede mus udviklede vi en optimeret dissociationsprotokol, der understøtter høj cellegabilitet og gør det muligt at detektere diskrete delpopulationer ved flowcytometri.

Rygmarvsskade er skabt ved fuldstændig transsektion af bryst rygmarven. På tidspunktet for vævshøsten perfunderes dyret med fosfatbufferet saltvand under dyb anæstesi, og blærer høstes i Tyrodes buffer. Væv hakkes før inkubation i fordøjelsesbuffer, der er optimeret baseret på kollagenindholdet i museblæren som bestemt ved forhør af offentligt tilgængelige genekspressionsdatabaser. Efter generering af en enkelt celleaffjedring analyseres materialet ved flowcytometri til vurdering af celle levedygtighed, cellenummer og specifikke delpopulationer. Vi viser, at metoden giver cellepopulationer med større end 90% levedygtighed og robust repræsentation af celler af mesenchymal og epiteloprindelse. Denne metode vil muliggøre nøjagtig downstream-analyse af diskrete celletyper i museblæren og potentielt andre organer.

Introduction

Perturbationer af normal urinblærefunktion kan føre til nedsat livskvalitet for mange individer. For at få en bedre forståelse af, hvordan skade eller sygdom afsporer normal blærefunktion, er det vigtigt at undersøge den normale biologiske tilstand af celler i blæren, og hvordan de ændrer sig under eksperimentel forstyrrer. Til dato er de specifikke cellepopulationer, der bor i urinblæren, og hvordan de ændrer sig med skade, imidlertid blevet ufuldstændigt karakteriseret.

Enkeltcelleprofileringsmetoder såsom flowcytometri eller enkeltcellet RNA-sekventering (scRNA-seq) har potentiale til at kaste lys over specifikke celletyper i blæren. For at disse metoder kan være informativt væv, skal de dog fordøjes på en måde, der ikke påvirker levedygtigheden, genekspressionen og repræsentative cellepopulationprocenter af det høstede væv. Protokoller, der anvender enzymatisk opdeling, kan påvirke overflademarkørudtryk gennem vilkårlig proteaseaktivitet¹, hvilket påvirker celleidentifikationen ved flowcytometri, mens dissociationsprocessen selv kan føre til induktion af umiddelbare tidlige gener, som beskrevet for nylig af Van den Brink og kolleger². Forfatterne viste, at selv om den dissociationsramte delpopulation var lille, kunne det udløse et stærkt forurenende signal i bulkudtryksundersøgelser på grund af de høje ekspressionsniveauer for umiddelbare tidlige gener. Desuden påvirkede varigheden af dissociationsprotokollen påviste bulkudtryksniveauer af gener, der viste sig at være unikke for nogle delpopulationer. Således kan enkeltcelledatasæt, der genereres uden at tage højde for virkningen af dissociationsprotokollen, give genekspressionsændringer som følge af dissociationsmetoden i modsætning til underliggende biologi. Disse observationer tyder på, at offentliggjorte enkeltcellede transskriptionsdata skal fortolkes med forsigtighed, og at resultaterne skal valideres ved hjælp af uafhængige metoder.

Selv om barske og langvarige dissociationsmetoder kan ændre genekspression i celler²; effektiv isolering af celler er afgørende for at opnå nøjagtig repræsentation af de tilstedeværende celletyper. Da blæren er et komplekst organ bestående af flere celletyper, kan nogle populationer såsom urotelceller eller stromale celler være relativt underrepræsenteret, mens andre celletyper såsom fibroblaster findes inden for ekstracellulær matrix og kan være udfordrende at isolere. Dissociation bliver endnu mere^udfordrende,hvis blæren har gennemgået en betydelig ombygning og fibrose som den , der observeres i rygmarvsskade³,⁴ eller blæreudtag obstruktion^5,6.

Her beskriver vi en optimeret vævsafkoblingsmetode til downstream-enkeltcelleanalyse i rygmarvsskadet museblære. Ved hjælp af flowcytometri sammenlignede vi fire enzymatiske fordøjelsesprotokoller for deres evne til at give en enkelt celleaffjedring, understøtte celle levedygtighed og opretholde den korrekte andel af cellepopulationer. Baseret på denne analyse konkluderer vi, at minimering af celledød, cellulære aggregater, ikke-cellulære nukleinsyrer og potentielle hæmmere af downstream-analyse er afgørende for at opnå data af høj kvalitet.

Protocol

Procedurerne blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. Alle eksperimenter blev godkendt af Animal Care and Use Committee of Boston Children’s Hospital. BEMÆRK: Mus blev anbragt i et AAALAC-akkrediteret dyreanlæg med ad libitum adgang til mad og vand. Kvindelige mus ved 8\u201212 uger blev brugt til disse eksperimenter. I betragtning af skadens art blev der givet yderligere ernæringsmæssig berigelse til mus for at sikre deres velbefindende. 1. Lav thoracic rygmarvstranssektion hos mus Forberedelse før rygmarvstranssektionBEMÆRK: De kirurgiske instrumenter, der kræves til denne procedure, er mikro dissekere fjeder saks, mikro dissekere pincet, mikro suturering nål driver, hæmostater, og 7-0 polyglactin 910 suturer. Andre kirurgiske forsyninger, der kræves, er kirurgiske gardiner, sterile plader til kirurgisk felt, gaze svampe, bomuld-tip applikatorer, og 1 mL sprøjter med 25 G nåle. Autoklave de kirurgiske instrumenter og forsyninger forud for operationen. Rengør det kirurgiske område og varmepuderne med alkoholservietter. Den ene varmepude vil blive brugt under operationen og den anden i den umiddelbare postoperative periode til at opretholde dyrets kropstemperatur, indtil det genvinder fuld aktivitet. Brug forstørrelsesglas lup (2,5 x eller mere) til at udføre den kirurgiske procedure. Tænd for varmepuderne, lyskilden og glasperle sterilisatoren for at være klar til brug under proceduren. Åbn de kirurgiske gardiner og instrumenterne. Brug sterile handsker til at drapere det kirurgiske felt og placere instrumenterne i det kirurgiske felt. Tilberedning af dyrene Bring musene til procedurerummet og medbring også et rent bur til rygmarvsskadede mus. Håndenæstesi administreres ved at placere musen i induktionskammeret med isofluranflow indstillet til 3,0%, iltstrøm ved 1 L/min. og suge ved 20 mmHg, indtil der ikke er nogen pote-knivspids respons. Vej straks dyret og læg derefter dyret i den udsatte position på varmepuden. Placer bedøvelseskeflen tæt over musens næse, skift gasstrømmen fra induktionskammeret til næsekeflen, og sæt isofluranstrømmen til 2% og iltstrømmen til 1 L/min. Bekræft, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet med fraværet af respons på pote-knivspids. Tape dyret lemmer til varmepuden. Placer et rullet stykke gaze svamp under den nederste brystet for at hæve og flex åbne den nederste brysthvirvler. Påfør oftalmisk smøremiddel på begge øjne. Administrere smertestillende medicin (Meloxicam, 10 mg/kg, subkutan) og antibiotika (Enrofloxacin, 5 mg/kg, subkutanly).BEMÆRK: Slutbrugere bør bruge smertestillende medicin og antibiotika anbefalet af deres lokale dyrepleje og brug udvalg. Palpate den mest fremtrædende spinøse proces i brysthvirvelsøjlen, som typisk svarer til T13 spinøs proces7. Barber et langsgående rektangelområde på bagsiden af musen fra den nederste hals til lige under den mest fremtrædende spinøse proces (T13) og i 1 cm på hver side af midterlinjen. Kirurgisk procedure Forbered det barberede område med 10% povidone jodopløsning og 70% ethanol tre gange alternativt på en cirkulær måde startende fra indsnitsstedet, der arbejder udad, og dæk derefter dyret med steril 4 x 4 gaze svamp med et vindue i midten, der ligger over det kirurgiske felt. Lav 1,5 cm snit i midten af ryggen ved hjælp af fin saks, der slutter ved den mest fremtrædende spinøse proces (T13). Snittet skal omfatte huden og overfladisk fascia. Ved hjælp af en saks adskille huden og overfladisk fascia på hver side for at udsætte spinøse processer og de omkringliggende paraspinous muskler. Ved hjælp af skarpe og stumpe dissektion adskille musklerne fra spinøse processer og laminae af T9, T10, og T11 ryghvirvler. Skarpt opdele interspinous ledbånd mellem T9 og T10 og mellem T10 og T11 ved hjælp af fine saks og derefter punktafgifter spinous processen med T10 og omhyggeligt udføre T10 laminectomy bilateralt at udsætte rygmarven. Sørg for, at laminae er helt fjernet. Transektere rygmarven ved hjælp af fine saks. Minimal blødning opstår normalt på dette tidspunkt på grund af transsektion af rygmarvsfartøjerne. Komprimer blødningsområdet med en steril bomuldsspidsapplikator for at opnå hemostase. Efter at have bekræftet komplet hemostasis, lukke huden med 7-0 polyglactin 910 kontinuerlige suturer. Der gives 1 ml saltvandsopløsning subkutalt for at forhindre postoperativ dehydrering. Postoperativ pleje Placer dyret på en varmepude, indtil der er sket fuld genopretning, og overfør derefter til et bur for kun rygmarvsskadede mus. Postoperativ pleje omfatter daglig observation og vejning af dyrene og overvågning af indsnitsstedet for tegn på infektion i op til 7 dage. Der gives 1 mL saltvandsopløsning, smertestillende (meloxicam 10 mg/kg) og antibiotika (enrofloxacin 5 mg/kg) alt sammen subkutan dagligt i 3 dage.BEMÆRK: Slutbrugere bør bruge smertestillende medicin og antibiotika anbefalet af deres lokale dyrepleje og brug udvalg. Udfør manuelt blæreudtryk (Credé-manøvre) hver 12. time, indtil dyret er i stand til at urinere alene (normalt om 10 til 14 dage). Hold dyret med den ene hånd og massér underlivet med den anden hånd, føl og komprimer derefter forsigtigt den udspilede urinblære med pegefingeren og tommelfingeren. Blid forbigående kompression bør skifte med afslapning. Efter manuel udtryk, vask underlivet med vand fra hanen og tør forsigtigt med køkkenrulle uden overdreven gnidning.BEMÆRK: En lille størrelse af blæren før begyndelsen af udtrykket og bevæbningen af underlivet med urin er tegn på, at dyret har fået evnen til at annullere alene. For at minimere vægttab, give ernæringsmæssig berigelse til mus i form af nærende gel og andre nærende godbidder (bacon softies, frugt crunchies og veggie bid) placeret på gulvet i buret for nem adgang BEMÆRK: I denne undersøgelse, mus blev perfunderes og blærer indkøbt på 8 uger efter SCI. Postoperative komplikationer Minimere risikoen for brud på blæren på grund af overzealous manuel blære udtryk ved ikke fuldt ud at udtrykke blæren. Undgå excoriation af perineal hud fra kontinuerlig udsættelse for urin drible fra inkompetente lukkemuskel gennem vask af perineal regionen med postevand. Minimer inflammation ved anvendelse af tredobbelt antibiotisk salve.BEMÆRK: Urethral obstruktion på grund af blodprop i perioden med forbigående hæmaturi eller fra sædkoagulum på grund af retrograd ejakulation hos hanmus kan forekomme efter rygmarvsskade. Komplet urethral obstruktion hos mandlige mus ofte kulminerer i blære brud og død. Det er vores erfaring, at hyppigheden af urethral obstruktion hos mandlige mus, der førte til døden, var 10%. 2. Udtagning af perfusion og væv BEMÆRK: Ved downstream-analyser af visse celletyper såsom immunceller i perifere væv er det gavnligt at fjerne blod ved perfusion på tidspunktet for vævshøsten som beskrevet nedenfor. Administrere anæstesi som nævnt i den kirurgiske procedure (trin 2.2) og bekræfte, at dyret er tilstrækkeligt bedøvet uden forepaw-pinch respons (dyret er paraplegiker, derfor bagbenene har mindsket fornemmelse og hindpaw-pinch respons bliver irrelevant). Placer dyret i liggende stilling og svaber maven og brystet med 70% ethanol for at våd pelsen for at forhindre det i at komme ind på operationsstedet. Udfør en laparotomi fra bækkenet til mellemgulvet. Skær mellemgulvet væk fra ribbenene.BEMÆRK: Efter dette trin er hastigheden vigtig, da brysttryksforskellen ikke længere eksisterer, og lungerne ikke kan pustes op, så dyret begynder at kvæles. Skær brystkassen op langs ribbenene på venstre og højre side efter knoglebruskkanten på en linje parallelt med brystbenet, begyndende ved mellemgulvet og fortsætter så langt som til det første ribben. Placer den komplette forreste brystvæg over dyrets hoved og fastgør den i denne position ved hjælp af håndklædeklemmer. Afskær ikke den forreste brystvæg, da dette vil medføre alvorlige blødninger fra de to indre brystarterier. Skær pericardiumet væk med en fin saks. Tilslut en 23 G nål til perfusionsapparatet, indsæt det derefter i venstre ventrikel og langsomt ind i aortaen, og pas på ikke at punktere det.BEMÆRK: Perfusionsapparatet består af en perfusionspumpe og en 50 mL sprøjte, der er forbundet med intravenøs slange. Start perfusionen og lav hurtigt et lille snit med spidsen af den fine saks i højre atrium til dræning. Pas på ikke at introducere luftbobler under væskeinfusion. Udfør perfusion med fosfat buffered saltvandsopløsning (PBS) køre ved 15 ml/min. Perfusion er fuldstændig, når dræningen er klar, og leverens lette farve opnås (Figur 1).BEMÆRK: Den gennemsnitlige tid for perfusion var 3,5-4 min. Utilstrækkelig perfusion manifesteres som langsom progression af blanchering af væv og skyldes normalt forkert placering af nålen i venstre hjertekammer. Justering af nålen og forlængelse af varigheden af perfusion i 1 til 2 minutter vil sikre tilstrækkelig perfusion af væv. Perfusionen afbrydes, og blæren dissekeres uden vaskulære pedikler og urinrør, og den anbringes i et mikrocentrifugerør, der indeholder iskold Tyrodes opløsning. 3. Fordøjelsen af urinblæren i kontrol og rygmarvsskadede mus BEMÆRK: For at formulere en effektiv fordøjelsesblanding, der er skræddersyet til musepibeblære, forsøgte vi at justere den enhed af enzymer, der bruges til at nedbryde de fremherskende ekstracellulære matrixkomponenter som kollagen og hyaluronsyre. Derfor brugte vi offentligt tilgængelige RNA-sekventeringsdata genereret af Mouse ENCODE-projektet (BioProject: PRJNA66167) til at udtrække læsninger pr. kilobase pr. million (RPKM) og Tabula Muris8 til vurdering af rumligt udtryk i blæren. Kollagen 1, 3 og 6 var de tre mest udtrykte gener blandt 42 forskellige kollagener (Figur 2A). Udtrykket af disse kollagener og hyaluronan synthase 1 (Has1) blev for det meste observeret i muskelceller og fibroblaster i blærevæggen (Figur 2B). Fremstilling af buffere og opløsninger Forbered natriumtyrolodeopløsning i henhold til tabel 1 i en ren 500 ml flaske. Tilføj 300 mL ddH2O. Opløsningen er sur efter tilberedning. Juster pH til 7,4 ved hjælp af NaOH. Volumen bringes op på 500 mL ved hjælp af dobbeltdestilleret H2O, derefter aliquot og opbevares ved -20 °C.BEMÆRK: Denne buffer opretholder pH-balancen og den osmotiske balance i fordøjelsesbufferen og forsyner cellerne med vand og essentielle uorganiske ioner. Den indeholder magnesium, såvel som glukose som energikilde. Kaliummet i opløsningen giver beskyttende virkninger på elektromekanisk aktivitet i den isolerede celleopløsning. Pulveriserede salte er hygroskopiske og bør beskyttes mod fugt. Hele indholdet af blandingen skal anvendes umiddelbart efter tilberedningen. Det anbefales ikke at forberede en koncentreret saltopløsning, da der kan dannes bundfald. Sterilisering ved hjælp af filtrering (0,22 μm filter) kan udføres, hvis cellerne skal dyrkes efter analyse. Forbered enzymatisk fordøjelsesopløsning i et 15 ml konisk rør ved at tilsætte anbefalede mængder og mængder for hver komponent (tabel 2). Der tilsættes natriumtyrolodeopløsning op til 2,5 ml. Vortex grundigt at opløse.BEMÆRK: Papain er en sulfhydryl protease fra Carica papaya latex. Papain har bred specificitet, og det vil nedbryde de fleste protein substrater9. Papain har vist sig mindre skadelig og mere effektiv end andre proteaser i celle dissociation protokoller10. Vi giver nærmere oplysninger om de fire dissociationsprotokoller i tabel 2; vi observerede protokol afsnit 3 for at understøtte den højeste levedygtighed (93%) af celleaffjedringer fremstillet af museblære. Dissociationsprocedure og forberedelse af cellesuspension Saml blæren fra mus efter perfusion. Punktere blæren til at frigive indhold, hvis nogen. Der tilsættes 100 μL tyrodeopløsning til et tomt 1,5 ml centrifugerør og tara. Placer blæren i røret og veje igen for at bestemme en nøjagtig blærevægt. Placer blæren på en 10 cm petriskål på is og tilsæt 100 μL af Tyrodes opløsning til hakke. Brug kirurgisk saks, skåret stykker så små som muligt og samtidig minimere hakke tid til ikke mere end 2 \u20123 min per blære. Hvis du samler blærevæv fra flere dyr, hakkes blærerne på én gang. Det hakkede blærevæv overføres ved hjælp af en bredboret pipetspids til 2,5 mL fordøjelsesbuffer for hver blære. Juster lydstyrken, hvis flere blærer er samlet. Vævet inkuberes i fordøjelsesopløsning ved 37 °C i en inkubator på en nutatorblander i 40 min. I slutningen af inkubationsperioden skal du fjerne fordøjelsesrøret fra inkubatoren. Triturat (pipet op og ned) fordøjelsesopløsning ved hjælp af en 5 ml pipette i 1 min. Centrifuge i 10 minutter ved 350 x g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og pelletlen genbruges i 1 ml celleløsning. Placer i en 37 °C inkubator på nutator mixer i 10 min. Centrifuge i 10 minutter ved 350 x g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og pelletlen genbruges i 1 mL RBC lysis buffer (1x). Inkuber i 1 min. Tilsæt 9 mL PBS for at fortynde RBC-bufferen og stoppe RBC lysis. Der overføres celler gennem 70 μm cellesien i 50 mL konisk rør ved hjælp af stemplet fra en sprøjte til let at skrabe cellesien for at sikre fuld cellepassage. Sørg for at indsamle væsken, der passerer gennem si, men kan blive fanget på undersiden af si. Centrifuge i 10 minutter ved 350 x g ved 4 °C. Supernatanten fjernes, og pelleten genbruges i 200 μL cellepletbuffer (PBS med 2% FBS). Tæl cellerne. Immunolabeling af specifikke celler til flowcytometriBEMÆRK: For at detektere forskellige typer celler i blæren designede vi et multifarvet flow-cytometripanel. For at udføre kompensation og udtænke en passende gating-strategi inkluderer vi ikke-tilbageholdte og fluorescens minus en (FMO) kontrol. FMO kontrol er vigtige for gate positiv befolkning, især når den positive fraktion er svag. Farvningsproceduren er som følger. Blokering af FcγRII/III-receptorer på cellerBEMÆRK: Vi anbefaler at blokere uspecifik binding af monoklonale antistoffer ved præinkubation af celler med monoklonale anti-Fc receptorantistoffer eller rekombinant Fc-protein. Cellerne vaskes ved centrifugering ved 350 x g i 5 min ved 4 °C og tilsættes cellebegæringsbuffer. Udsmid supernatant- og bloker FcγRII/III-receptorer på celler for at forhindre ikke-specifik antistofbegæring ved at tilsætte CD16- og CD32-antistoffer i cellebejdningsbuffer ved fortynding på 1:100. Inkuber på is i 10 minutter.BEMÆRK: Der er ingen grund til at vaske cellerne; celler kan farves direkte efter dette stadium. Farvning af MDO’erBEMÆRK: En fluorescens minus 1 (FMO) kontrol er et rør af alle fluorochromes, der anvendes i forsøget, der indeholder alle fluorchromer undtagen én. Hvis man f.eks. har 4 forskellige fluorochromer (A, B C og D + Annexin V og propidiumididid (PI)), skal FMO-rørene fremstilles som følger. FMO Tube 1: Antistoffer konjugeret med B, C, D fluorochromes + (Annexin V og PI); FMO Tube 2: Antistoffer konjugeret med A, C, D fluorochromes + (Annexin V og PI); FMO Tube 3: Antistoffer konjugeret med A, B, C fluorochromes + (Annexin V og PI); FMO Tube 4: Antistoffer konjugeret med A, B, C, D fluorochromes + (Annexin V); FMO Tube 5: Antistoffer konjugeret med A, B, C, D fluorochromes + (PI). Overvej arten af det konjugerede fluorkrom for bilagin V-antistoffet. Farvning af de blokerede celler med de ønskede antistoffer Inkuber blokerede celler med passende masterblandinger af fluorophorekonjugerede antistoffer mod de ønskede proteiner i 20 minutter på is beskyttet mod lys. Husk at medtage FMOs. Celler med 1 mL cellepletbuffer tilsættes til hvert rør og centrifugeres derefter igen ved 350 x g i 5 min ved 10 °C. Supernatanten kasseres, og cellepillen genbruges i 200 μL cellepletbuffer. Hold på is, indtil fluorescens data kan erhverves ved hjælp af en flow cytometer. Anvend Annexin V/ PI-pletten. Der fremstilles en arbejdsopløsning pi (100 μg/mL) i 1x bilagsbindingsbuffer som beskrevet i fabrikantens protokol for udstyr til døde celler. Bestem celletætheden, og noter den buffer og diskenhed, de er gemt i. Centrifugeprøver ved 350 x g i 5 minutter kasseres supernatanten og genanvendes celler i 1x Annexin-bindingsbuffer til en massefylde på ~1 x 106 celler/mL i et volumen på 100 μL. Der tilsættes FITC-Annexin V (5 μL) og PI-arbejdsopløsning (1 μL) til hver prøve (100 μL), som beskrevet i fabrikantens protokol, og der inkuberes ved stuetemperatur i 15 min. Der tilsættes 400 μL 1x bilagsbindende buffer til prøverne, blandes ved inversion og holdes på is, indtil der strømmes cytometri. FACS-kalibrering Flowcytometri og renhedskontrol Start flow cytometry analyse ved at måle de ikke-indgroede celler til at afgrænse celle morfologi og trug af fluorchromes. Juster sidespredningen (SSC) og fremad scatter (FSC) ved at ændre spændingerne for hver fluorescensparameter. Fluorescensemissionen måles ved 530 nm (bilag I V) og >575 nm (PI). Definer den negative population i det første årti ved hjælp af gitrene på hvert punktområde. Placer hver FMO-kontrol i cytometeret, og ret spektraloverlapningen, indtil de negative og positive populationsmedianer er justeret. Mål 100.000 hændelser. Mål celler, der er farvet med specifikke markører, og opret porte til cellepopulationer af interesse. Dataanalyse Indsaml dataene fra flowcytometeret. Åbn softwaren for at visualisere arbejdsområdet til analyse. Oprette et arbejdsområde Importer FCS-filer ved at trække dem ind i arbejdsområdet. Filer vil være synlige i eksempel- og gruppesektionen i arbejdsområdet. Dobbeltklik i eksempelnavnet for at åbne filen. Brug side scatter area (SSC-A) til y-aksen og det forreste punktområde (FSC-A) til x-aksen (Figur 3A). Klik på ikonet for polygongating. Opret en port omkring cellepopulationen af interesse i prikplottet ved at klikke for at oprette en portnode og derefter fortsætte med at klikke rundt om cellepopulationen, indtil den er fuldført. dobbeltklik for at lukke porten. Navngiv porten i henhold til den fangede population (f.eks. “Alle celler”), og klik på OK.BEMÆRK: Hvis du dobbeltklikker i porten “Alle celler”, åbnes et nyt grafvindue, der kun viser hændelserne i “Alle celler”. Juster y-aksen i den nye punktplan til SSC-H (sideopstrejningshøjde) ved at klikke i den sorte pil og vælge at ændre y-aksen.BEMÆRK: Denne gates for enkelte celler (singlets) og udelukker doublets eller større aggregater(Figur 3B). Da enkelte celler har proportional bredde og længde, bør de repræsenteres som en population på diagonalen. Celler, der falder uden for denne diagonale port, er doublets eller større aggregater. Dobbeltklik på porten for at analysere nekrotiske (PI-positive), tidlige apptotiske (Annexin V-positive, PI-negative) og sene apptotiske (Annexin V-positive, PI-negative) celler(Figur 3C). Mærk x-aksen som Annexin V og y-aksen som PI.BEMÆRK: I nogle tilfælde, hvor signalintensiteten er lav, kan cellepopulationer synes at have negative fluorescensværdier som følge af korrektion for baggrund. I dette tilfælde anbefales det at udføre en to-eksponentiel transformation. Det kan du gøre ved at klikke på T ud for y-aksen og vælge Tilpas akse. I det nye vindue skal du ændre skalaen til bieksponentiel (Biex) ved at føje negative værdier til akserne ved at øge breddebasisen og klikke på Anvend. Dette vil forbedre afviklingen af hændelser med lav signalintensitet. Vis data som en optællingsafbildning. Brug fanen Indstilling lige under x-aksen, og vælg tællerplot i menuen. Tegn en Quat gate på plottet for at definere 4 diskrete målgrupper. Klik øverst i vinduet for at åbne layouteditoren ved at klikke i Layouteditor og trække populationer til hvert enkelt område. Placer plots i layouteditoren ved at trække og slippe populationer fra arbejdsområdet til layouteditorvinduet. Visualisering ved hjælp af histogrammer Vælg histogram under fanen Indstillinger. Påfør en port for at vælge Annexin V-positive celler. Alternativt kan positive og negative populationer defineres ved hjælp af bisektorværktøjet. Eksempelsektionen skal nu vise de forskellige populationer, der har været form og deres hierarki. Hvis du vil sammenligne eksempler, skal du trække alle histogrammerne oven på hinanden. højreklik på histogrammet, og vælg Forskudtfra histogrammet . Tilføje statistiske analyser Åbn fanen Statistik ved at dobbeltklikke på interessepopulationen. Vælg den funktion, der skal anvendes, og den parameter, der skal bruges. Gentag med andre populationer, ved at trække Sigma-ikonet ind i befolkningsnavnet. Analysen anvendes på alle prøver ved at vælge gatingstrategien fra stikprøven af interesse og trække den ind i den gruppe, der er defineret af interessemarkøren, f.eks. Opret porte i FMO-kontrolprøverne, og definer negative og positive populationer. denne gating-strategi vil blive anvendt på hele eksperimentet (Figur 3D\u2012F).BEMÆRK: Kontroller hver enkelt prøve enkeltvis for at sikre, at gating er korrekt, og rediger om nødvendigt. Hvis celler er blevet plettet med markørantistof (f.eks. CD45), skal du bruge den tilsvarende FMO og porten i overensstemmelse hermed. Hvis du vil eksportere layoutet, skal du klikke på Filer | Eksporter | Vælg filformat (f.eks. jpg, pdf). Klik på Opret tabel for at åbne et vindue med den endelige version af tabellen. Eksporter tabellen ved at vælge | Gem som | Filnavn.

Representative Results

Kirurgisk procedureSuccesen med thorax rygmarvstranssektion bestemmes ved vurdering af en række parametre, hvoraf den mest oplagte er hindlimb lammelse. Dyret bevæger sig kun ved hjælp af sine forben og trækker sine bagben. Ellers er aktivitetsniveauer, herunder fodring, pleje og årvågenhed, typisk normale. Derudover mister dyr viljesbestemt blærekontrol, hvilket resulterer i, at investigator har behov for manuel blæreudtryk hver 12. time, indtil refleksen bortfalder, vender tilbage 10 til 14 dage efter skaden. Efter aktiv dødshjælp, yderligere tegn på succes af skaden vedrører primært stigningen i blære-til-krop vægt ratio, tegn på væv remodeling. Histologisk analyse afslører hyperplasi inden for både urotel og glatte muskelrum3. Forberedelse af suspension af en enkelt celleVed hjælp af offentligt tilgængelige ekspressionsdata blev berigelsen af blærevæv for ekstracellulære matrixproteiner bestemt (figur 2) og anvendt til at informere formuleringen af fordøjelsesblandingen. Da kollagen er centrale komponenter i blærevæggen11,12, først forsøgte vi at bestemme de mest rigelige kollagen (r) i museblæren ved hjælp af RNA profilering datasæt genereret af Mouse ENCODE projekt13. Vores analyse viste, at Kollagen 1A1, kollagen 3A1, kollagen 1A2 og kollagen 6A1 er mest rigelige kollagen typer i museblæren (Figur 2A). Vi har også brugt Tabula Muris (et kompendium af enkelt celle transcriptome data fra mus (Mus musculus))8 til at bestemme mRNA udtryk niveau kollagen 1, 3, 6 og hyaluronan. Dataene giver mulighed for direkte og kontrolleret sammenligning af genekspression i celletyper, der deles mellem væv. Denne analyse viste, at udtrykket af disse ekstracellulære matrixkomponenter er mere udbredt i mesenchymale celletyper snarere end urothelium (Figur 2B). Virkningen af dissociation på levedygtigheden af isolerede celler fra blærenFlowcytometrianalyse viste, at enzymatisk fordøjelse ved hjælp af de 4 forskellige protokoller gav en rentabilitet på henholdsvis 83%, 86%, 93% eller 90%. Protokolafsnit 3 blev således anset for at være mest værdifuldt for bevarelsen af cellernes levedygtighed. Vi bemærkede også, at ca. 4% af cellerne var nekrotiske (PI+/Annexin V-) (Figur 4A). Disse observationer understreger fordøjelsesprotokollens effektivitet og den deraf følgende fordel for cellegabiliteten. Effekt af rygmarvsskader på forskellige populationer af celler i blærenVi observerede en betydelig stigning i det samlede celletal i blærer af SCI mus i forhold til kontrol. Mønsteret af prikplotterne fra SCI-blærer var også lidt anderledes i overensstemmelse med igangværende organombygning på grund af rygmarvsskader(figur 4B: første kolonne). Sammenlignet med kontrollerne viste blærerne fra SCI-dyr en betydelig stigning i CD45-positive celler. Figur 1: Repræsentativ perfusionsafslutning med lysere farve på leveren. (A) Demonstrerer leverfarven i begyndelsen af perfusionen. (B) Viser den lette leverfarve i slutningen af perfusionen. Musen i (A) havde rygmarvstranssektion to uger før perfusion resulterer i blære hypertrofi og dens fremspring ud af bækkenet i modsætning til musen i (B), der ikke har rygmarvsskade; i dette tilfælde blæren er lille og skjult i bækkenet. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Transskriberingstryk af ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) i museblæren. (A) Søjlediagram med 43 forskellige kollagentyper. Udtrykket er angivet af Læser Per Kilobase af udskrift, per million kortlagt læser (RPKM) (data er indsamlet fra BioProject: PRJNA66167)14. (B) Violinplotter med genekspression i celletyper fremstillet af mikrofluidisk dråbebaseret 3′-endetælling i en pulje af mandlige og kvindelige dissocierede urinblæreprøver (han- og hunner). Optællingerne blev lognormaliseret for hver celle ved hjælp af den naturlige logaritme på 1+ antal pr. million indbyggere (CPM+1)8. Der blev tilføjet en pseudotælling på 1 CPM, før der blev logaritmer. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3: Gating-strategi og FMO-kontroller til bestemmelse af fluorescensspredning. (A)Udvælgelse af cellepopulation. (B) Gating strategi for singlets. (C) Gating for nekrotiske og tidlige og sene apoptotiske celler ved hjælp af PI- og Annexin V-antistof. (D\u2012F) Et skematisk punktområde med flerfarvet flowcytometri (f.eks. antistoffer konjugeret med A, B, C, D fluorochromes + (Annexin V og PI). Dette viser fluorescensen spredt ind i antistoffet med fluorokrom A-kanal vist af FMO-styringen sammenlignet med en ikke-indgroet kontrol. Orange sleblet linje repræsenterer FMO gating grænse i forhold til unstained grænse i rødt. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: Flowcytometri af forskellige celletyper i blæren. (A)Bilag i V/PI dobbelte farvningsstrømsdiagrammer. De forskellige kombinationer af enzymer og kemikalier, der anvendes til hver protokol, er repræsenteret foran det tilsvarende levedygtighedsområde. Disse data viser, at protokolafsnit 3 har den højeste levedygtighed. (B) Repræsentative histogrammer, der illustrerer intensiteten af Ly-6A/E (Sca-1) og CD326 (Ep-CAM), der påvises i enkelte kanaler. (C) SCI’s indvirkning på cellepopulationen i museblæren. Overpanelet viser resultater af farvning på tre dissociated blærer opnået fra kontrol ikke-kirurgiske mus og lavere panel viser resultaterne af farvning på tre dyr med SCI. Den første kolonne er den samlede cellepopulation. I den anden kolonne vises den enkelte gating-markering. Den tredje kolonne viser underpopulationen af dynamiske celler, der er negative for B-celler, T-celler og NK-celler. Den fjerde kolonne viser farvningen for levende celler positiv for CD45. Klik her for at se en større version af dette tal. Komponent Beløb (for 500 mL) Molarity Nacl 4.091 g 140 mM KCl 0,186 g 5 mM MgCl2 0,0476 g 1 mM D-glukose 0,9 g 10 mM HEPES 1,19 g 10 mM Tabel 1: Komponenter til fremstilling af Tyrodes opløsning. De angivne komponenter er til fremstilling af 500 ml Tyrodes opløsning. Komponent Beløb Protokol afsnit 1 Protokol afsnit 2 Protokol afsnit 3 Protokol afsnit 4 Bsa 5 mg Ja Ja Ja Ja CaCl2 0,03 mM Ja Ja Ja Ja Kollagen type I 132,5 enheder Ja Ja Ja Ja Kollagen type III 96.4 enheder Ja Ja Ja Ja Kollagen type VI 50 enheder – – Ja – DNase 10 enheder Ja Ja Ja – Papain 115 enheder – – Ja Ja Pan kollagen 50 enheder – – Ja Ja Hyaluronidase 10,5 enheder – – Ja Ja Dispase II 1.25 enheder Ja Ja – – Løsning til fjernelse af celler 1 mL Ja – Ja – Rekombinant enzym 1 mL – Ja – Ja Tabel 2: Komponenter til forberedelse af fordøjelsesbuffer. De angivne komponenter er til fremstilling af 2,5 mL fordøjelsesblanding (1 U katalyserer hydrolysen af 1 μmol et substrat pr. minut ved 37 °C. Se produktdatabladet for definition af enhed for hvert enzym).

Discussion

Musen rygmarv skade model beskrevet her giver en reproducerbar metode til at skabe en funktionel blære stikkontakt obstruktion på grund af tab af koordinering mellem blære sammentrækning og eksterne urethral lukkemuskel afslapning. Dette fremkalder igen dyb ombygning af blærevæggen så tidligt som 2 uger efter skade karakteriseret ved udvidelse af urotel og glatte muskelrum. Kritiske trin i gennemførelsen af SCI-modellen hos gnavere omfatter (i) streng opmærksomhed på manuel blæreudtryk i den periode med spinalchok, der følger i 10\u201214 dage efter skade; ii) ernæringsmæssig berigelse for at minimere vægttab og (iii) afbødning af potentialet for urinskolldning, især for forsøg, der strækker sig ud over tilbagevenden af refleks annullering. Begrænsninger af modellen omfatter potentialet for urethral okklusion hos mus fra blodpropper i perioden med forbigående hæmaturi, og derudover hos hanmus fra sædkoagulum efter retrograd ejakulation efter operationen.

Den her beskrevne vævsafkoblingsmetode illustrerer vigtigheden af at overveje strukturelle ændringer i væv, der opstår som følge af den eksperimentelle fornærmelse, i dette tilfælde betydelig vævsremodellering efter SCI, der kan påvirke downstream-analyser. Med stigningen i enkeltcelleanalyser er det afgørende at sikre, at forskelle observeret i genekspression ikke blot er et resultat af dissociationsinducerede perturbationer, men virkelig er repræsentative for underliggende biologiske ændringer, der er relevante for sygdomsmodellen. Brugen af offentligt tilgængelige udtryksdata gjorde det muligt for os at ændre formuleringen af fordøjelsesbuffere for at sikre effektiv fordøjelse af ekstracellulær matrix og samtidig maksimere levedygtigheden. Yderligere ændringer, der kan overvejes i fremtidige applikationer, omfatter tilføjelsen af actinomycin D for at stoppe transskription af umiddelbare tidlige gener, der er følsomme over for dissociationsprotokol¹⁵.

Pipetting teknik er afgørende, når dissociating væv eller overføre celler, der allerede er i suspension. For at reducere fysisk skade på celler fra klipningskræfter er det vigtigt at pipette forsigtigt og langsomt under cellerepension. Det anbefales generelt at bruge bredborede pipettespidser. Hvis du bruger standard tips, er det især vigtigt at pipette celle suspensioner forsigtigt for at undgå forskydning kræfter, der ellers ville skade celler. Brug af cellestammer er uundgåelig i denne protokol, men cellekoncentrationen kan falde med 20% eller mere, ledsaget af et volumentab på 100 μL eller mere. Vi anbefaler, at cellekoncentrationen bestemmes efter belastning for at sikre et præcist celleantal.

I flowcytometri giver FMO-kontroller et mål for baggrund på grund af gennemblødning af signal fra overlappende emissionstoppe. De er ikke et mål for uspecifik antistofbinding eller baggrundspletter, der kan være til stede, når et antistof er inkluderet i den pågældende kanal. For at tage højde for den uspecifikke antistofbinding skal man medtage passende isotypekontroller. til baggrundsplejning, skal man medtage negative kontroller. Tilsammen sikrer disse kontroller nøjagtig måling af cellepopulationer.

Materials

2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia