En enkeltcelledissosiasjonstilnærming for molekylær analyse av urinblæren i musen etter ryggmargsskade

Summary

Målet med denne protokollen er å bruke en optimalisert vevdissosiasjonsprotokoll til en musemodell av ryggmargsskade og validere tilnærmingen for enkeltcelleanalyse ved flytcytometri.

Abstract

Vi beskriver implementeringen av ryggmargsskade hos mus for å fremkalle detrusor-sphincter dyssynergia, en funksjonell blæreutløpsobstruksjon og påfølgende blærevegg ombygging. For å lette vurderingen av blæreveggens cellulære sammensetning i ikke-skadet kontroll og ryggmargsskadede mus, utviklet vi en optimalisert dissosiasjonsprotokoll som støtter høy cellelevelighet og muliggjør påvisning av diskrete underpopulasjoner ved strømningscytometri.

Ryggmargsskade er skapt ved fullstendig transeksjon av thorax ryggmargen. På tidspunktet for vevshøsting er dyret gjennomsyret av fosfatbufret saltvann under dypbedøvelse og blærer høstes inn i Tyrodes buffer. Vev er hakket før inkubasjon i fordøyelsesbufferen som er optimalisert basert på kollageninnholdet i museblæren som bestemmes av avhør av offentlig tilgjengelige genuttrykksdatabaser. Etter generering av en enkeltcellesuspensjon analyseres materialet ved strømningscytometri for vurdering av cellelevbarhet, cellenummer og spesifikke underpopulasjoner. Vi viser at metoden gir cellepopulasjoner med større enn 90% levedyktighet, og robust representasjon av celler av mesenchymal og epitelopprinnelse. Denne metoden vil muliggjøre nøyaktig nedstrøms analyse av diskrete celletyper i museblæren og potensielt andre organer.

Introduction

Perturbasjoner av normal urinblærefunksjon kan føre til redusert livskvalitet for mange individer. For å få en bedre forståelse av hvordan skade eller sykdom avsporer normal blærefunksjon, er det viktig å undersøke den normale biologiske tilstanden til celler i blæren og hvordan de endres under eksperimentell perturbasjon. Til dags dato har imidlertid de spesifikke cellepopulasjonene som bor i urinblæren, og hvordan de endres med skade, blitt ufullstendig preget.

Encelleprofileringsmetoder som strømningscytometri eller enkeltcellede RNA-sekvensering (scRNA-seq) har potensial til å kaste lys over bestemte celletyper i blæren. Men for at disse tilnærmingene skal være informativt vev må fordøyes på en måte som ikke påvirker levedyktighet, genuttrykk og representative cellepopulasjonsprosenter av høstet vev. Protokoller som benytter enzymatisk disaggregation kan påvirke overflaten markør uttrykk gjennom ukritisk protease aktivitet¹, og dermed påvirker celleidentifikasjon ved flyt cytometri, mens dissosiasjonsprosessen i seg selv kan føre til induksjon av umiddelbare tidlige gener, som beskrevet nylig av Van den Brink og kolleger². Forfatterne viste at selv om dissosiasjonsrammede underbefolkningen var liten, kunne det utløse et sterkt forurensende signal i bulkuttrykksstudier på grunn av de høye uttrykksnivåene av umiddelbare tidlige gener. I tillegg oppdaget varigheten av dissosiasjonsprotokollen bulkuttrykksnivåer av gener som viste seg å være unike for noen underpopulasjoner. Enkeltcelledatasett generert uten å ta hensyn til virkningen av dissosiasjonsprotokollen kan derfor gi genuttrykksendringer som oppstår fra dissosiasjonsmetoden, i motsetning til underliggende biologi. Disse observasjonene tyder på at publiserte encellede transkripsjonsdata bør tolkes med forsiktighet, og at resultatene skal valideres ved uavhengige metoder.

Selv om harde og lange dissosiasjonsmetoder kan endre genuttrykket i^{cellene 2}; effektiv isolering av celler er avgjørende for å oppnå nøyaktig representasjon av celletypene som finnes. Siden blæren er et komplekst organ bestående av flere celletyper, kan noen populasjoner som urotheliale eller stromale celler være relativt underrepresentert, mens andre celletyper som fibroblaster finnes innenfor ekstracellulær matrise og kan være utfordrende å isolere. Dissosiasjon blir enda mer utfordrende hvis blæren har gjennomgått betydelig ombygging og fibrose som det observert i ryggmargsskade^3,4 eller blæreutløp obstruksjon^5,6.

Her beskriver vi en optimalisert vevdissosiasjonsmetode for nedstrøms enkeltcelleanalyse i ryggmargen skadet museblæren. Ved hjelp av strømningscytometri sammenlignet vi fire enzymatiske fordøyelsesprotokoller for deres evne til å gi en enkelt cellesuspensjon, støtte celle levedyktighet og opprettholde riktig andel av cellepopulasjoner. Basert på denne analysen konkluderer vi med at å minimere celledød, cellulære aggregater, ikke-cellulære nukleinsyrer og potensielle hemmere av nedstrømsanalyse er avgjørende for å oppnå data av høy kvalitet.

Protocol

Prosedyrene ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Alle eksperimenter ble godkjent av Animal Care and Use Committee of Boston Children’s Hospital. MERK: Mus ble plassert i et AAALAC-akkreditert dyreanlegg med ad libitum tilgang til mat og vann. Hunnmus ved 8\u201212 ukers alder ble brukt til disse eksperimentene. Gitt skadens art ble ytterligere ernæringsmessig berikelse gitt til mus for å sikre deres velvære. 1. Lav thorax ryggmargstranseksjon hos mus Forberedelse før ryggmargstranseksjonMERK: De kirurgiske instrumentene som kreves for denne prosedyren er mikro dissekering vårsaks, mikrodeserende tang, mikro suturing nåldriver, hemostater og 7-0 polyglactin 910 suturer. Andre kirurgiske forsyninger som kreves er kirurgiske gardiner, sterile ark for kirurgisk felt, gasbind svamper, bomull-tips applikatorer, og 1 ml sprøyter med 25 G nåler. Autoklav kirurgiske instrumenter og forsyninger før operasjonen. Rengjør det kirurgiske området og varmeputene med alkoholservietter. Den ene varmeputen vil bli brukt under operasjonen og den andre for den umiddelbare postoperative perioden for å opprettholde dyrets kroppstemperatur til den gjenvinner full aktivitet. Bruk forstørrelses loupes (2,5x eller mer) til å utføre den kirurgiske prosedyren. Slå på varmeputene, lyskilden og glassperlesterilisatoren for å være klar til bruk under prosedyren. Åpne kirurgiske gardiner og instrumentene. Bruk sterile hansker til å drapere det kirurgiske feltet og plasser instrumentene i operasjonsfeltet. Fremstilling av dyrene Ta musene til prosedyrerommet og ta også med et rent bur for ryggmargen skadede mus. Administrer anestesi ved å plassere musen i induksjonskammeret med isofluranstrømning satt til 3,0%, oksygenstrøm ved 1 l / min, og suge ved 20 mmHg til det ikke er pote-klemme respons. Vei umiddelbart dyret og plasser deretter dyret i utsatt stilling på varmeputen. Plasser bedøvelseskjeglen godt over musens nese, bytt gassstrømmen fra induksjonskammeret til nesekjeglen, og sett isofluranstrømmen til 2% og oksygenstrømmen til 1 L / min. Bekreft at dyret er tilstrekkelig bedøvet med fravær av respons på pote-klemme. Tape dyret lemmer til varmeputen. Plasser et rullet stykke gasbind svamp under den nedre brystet for å heve og bøye åpne nedre thorax ryggvirvler. Påfør oftalmisk smøremiddel på begge øynene. Administrer smertestillende medisiner (Meloksikam, 10 mg/kg, subkutant) og antibiotika (Enrofloksacin, 5 mg/kg, subkutant).MERK: Sluttbrukere bør bruke smertestillende medisiner og antibiotika anbefalt av deres lokale dyrepleie- og brukskomité. Palpate den mest fremtredende spinøse prosessen i thorax ryggraden som vanligvis tilsvarer T13 spinous prosess7. Barber et langsgående rektangelområde på baksiden av musen fra nedre hals til like under den mest fremtredende spinøse prosessen (T13) og i 1 cm på hver side av midtlinjen. Kirurgisk prosedyre Prep barbert området med 10% povidone jod løsning og 70% etanol tre ganger alternativt på en sirkulær måte som starter fra snittet området arbeider utover og deretter dekke dyret med sterile 4 x 4 gasbind svamp med et vindu i midten overliggende det kirurgiske feltet. Lag 1,5 cm snitt i midten av ryggen ved hjelp av fin saks som slutter på den mest fremtredende spinøse prosessen (T13). Snittet bør inkludere huden og overfladisk fascia. Ved hjelp av saks skiller huden og overfladisk fascia på hver side for å avsløre de spinøse prosessene og de omkringliggende paraspinous musklene. Ved hjelp av skarp og stump disseksjon skiller musklene fra de spinøse prosessene og laminae av T9, T10 og T11 ryggvirvler. Del de interspinous leddbåndene mellom T9 og T10 og mellom T10 og T11 kraftig ved hjelp av fin saks og deretter avgiftsdirektoratet den spinøse prosessen med T10 og utfør forsiktig T10 laminektomi bilateralt for å eksponere ryggmargen. Sørg for at laminering er helt utskåret. Transekte ryggmargen ved hjelp av fin saks. Minimal blødning oppstår vanligvis på dette punktet på grunn av transeksjon av ryggmargskarene. Komprimer blødningsområdet med en steril bomullstippapplikator for å oppnå hemostase. Etter å ha bekreftet fullstendig hemostase, lukk huden med 7-0 polyglactin 910 kontinuerlige suturer. Administrer 1 ml saltvannsoppløsning subkutant for å forhindre postoperativ dehydrering. Postoperativ omsorg Plasser dyret på en varmepute til full gjenoppretting har skjedd, og overfør deretter til et bur for bare ryggmargsskadede mus. Postoperativ omsorg inkluderer å observere og veie dyrene daglig, og overvåking av snittstedet for tegn på infeksjon i opptil 7 dager. Administrer 1 ml saltløsning, smertestillende (meloksikam 10 mg/kg) og antibiotika (enrofloksacin 5 mg/kg) alle subkutant daglig i 3 dager.MERK: Sluttbrukere bør bruke smertestillende medisiner og antibiotika anbefalt av deres lokale dyrepleie- og brukskomité. Utfør manuelt blæreuttrykk (Credé manøver) hver 12. Hold dyret med den ene hånden og masser underlivet med den andre hånden, og føl og komprimer forsiktig den distended urinblæren med pekefingeren og tommelen. Skånsom forbigående kompresjon bør veksle med avslapning. Etter manuell uttrykk, vask underlivet med vann fra springen og tørk forsiktig med papirhåndkle uten overdreven gnidning.MERK: En liten størrelse på blæren før begynnelsen av uttrykket og fukting av underlivet med urin er indikasjoner på at dyret har fått evnen til å annullere seg selv. For å minimere vekttap, gi ernæringsmessig berikelse til mus i form av næringsrik gel og andre næringsrike godbiter (bacon softies, frukt crunchies og veggie biter) plassert på gulvet i buret for enkel tilgang MERK: I denne studien ble mus perfused og blærer anskaffet på 8 uker etter SCI. Postoperative komplikasjoner Minimer potensialet for brudd på blæren på grunn av overivrig manuell blæreuttrykk ved ikke å uttrykke blæren fullt ut. Forhindre ekscoriasjon av perineal hud fra kontinuerlig eksponering for urin dribling fra inkompetent sphincter gjennom vasking av perineal regionen med vann fra springen. Minimer betennelse ved påføring av trippel antibiotika salve.MERK: Uretral obstruksjon på grunn av blodpropp i løpet av forbigående hematuri eller fra sædkoagulum på grunn av retrograd ejakulasjon hos hannmus kan oppstå etter ryggmargsskade. Fullstendig urintral obstruksjon hos hannmus kulminerer ofte i blærebrudd og død. Etter vår erfaring var hyppigheten av urintral obstruksjon hos hannmus som førte til døden 10%. 2. Perfusjon og vev innkjøp MERK: For nedstrøms analyser av visse celletyper som immunceller i perifert vev er det gunstig å fjerne blod ved perfusjon på tidspunktet for vevsinnhøsting, som beskrevet nedenfor. Administrer anestesi som nevnt i kirurgisk prosedyre (trinn 2.2) og bekreft at dyret er tilstrekkelig bedøvet uten forefalt-klemmerespons (dyret er paraplegisk, derfor har baklimbene redusert følelse og bakpott-klemmeresponsen blir irrelevant). Plasser dyret i liggende stilling og vattpinne magen og brystet med 70% etanol for å våt pelsen for å hindre at det kommer inn på operasjonsstedet. Utfør en midline laparotomi fra bekkenet til membranen. Klipp membranen bort fra ribbeina.MERK: Etter dette trinnet er hastighet viktig siden thoraxtrykkforskjellen ikke lenger eksisterer og lungene ikke kan blåse opp, slik at dyret begynner å kveles. Klipp thoraxen åpen langs ribbeina på venstre og høyre side etter beinbruskkanten på en linje parallelt med brystbenet, begynner ved membranen og fortsetter så langt som til det første ribbet. Plasser den komplette fremre thoraxveggen over dyrets hode og fest den i denne posisjonen ved hjelp av håndkleklemmer. Ikke klipp av den fremre thoraxveggen, da dette vil føre til alvorlig blødning fra de to indre thoraxarteriene. Klipp bort perikardiet med fin saks. Koble en 23 G nål til perfusjonsapparatet, sett den deretter inn i venstre ventrikkel og sakte inn i aorta, og ta vare på å ikke punktere den.MERK: Perfusjonsapparatet består av en perfusjonspumpe og 50 ml sprøyte koblet til intravenøs slange. Start perfusjonen og gjør raskt et lite kutt med spissen av fin saks i høyre atrium for drenering. Vær forsiktig så du ikke introduserer luftbobler under væskeinfusjon. Utfør perfusjon med fosfatbufret saltvannsløsning (PBS) som kjøres ved 15 ml/min. Perfusjon er fullført når drenering er klar og lett fargen på leveren oppnås (figur 1).MERK: Gjennomsnittlig tid for perfusjon var 3,5–4 min. Utilstrekkelig perfusjon manifesteres som langsom progresjon av blanchering av vev og skyldes vanligvis feil posisjonering av nålen i venstre ventrikkel. Justering av nålen og forlenge varigheten av perfusjon i 1 til 2 min vil sikre tilstrekkelig perfusjon av vev. Avslutt perfusjonen og disseker blæren fri for vaskulære pedikler og urinrør og legg den i et mikrocentrifugerør som inneholder iskald Tyrodes løsning. 3. Fordøyelsen av urinblære i kontroll og ryggmargsskadede mus MERK: For å formulere en effektiv fordøyelsesblanding som er skreddersydd for museurinblære, forsøkte vi å justere enheten av enzymer som brukes til å forringe de dominerende ekstracellulære matrisekomponentene som kollagen og hyaluronsyre. Derfor brukte vi offentlig tilgjengelige RNA-sekvenseringsdata generert av Mouse ENCODE-prosjektet (BioProject: PRJNA66167) til å trekke ut leser per kilobase per million (RPKM) og Tabula Muris8 for vurdering av romlig uttrykk i blæren. Kollagen 1, 3 og 6 var de tre mest uttrykte genene blant 42 forskjellige kollagen (figur 2A). Uttrykket av disse kollagen og hyaluronan syntase 1 (Has1) ble for det meste observert i muskelceller og fibroblaster i blæreveggen (figur 2B). Utarbeidelse av buffere og løsninger Forbered natriumtyridoppløsningen i henhold til tabell 1 i en ren flaske på 500 ml. Tilsett 300 ml ddH2O. Løsningen er sur etter tilberedning. Juster pH til 7,4 ved hjelp av NaOH. Ta volumet til 500 ml ved hjelp av dobbeltdestillert H2O, deretter aliquot og oppbevar ved -20 °C.MERK: Denne bufferen opprettholder pH- og osmotisk balanse i fordøyelsesbufferen og gir cellene vann og essensielle uorganiske ioner. Den inneholder magnesium, samt glukose som energikilde. Kaliumet i løsningen gir beskyttende effekter på elektromekanisk aktivitet i den isolerte celleløsningen. Pulverisertsalter er hygroskopiske og bør beskyttes mot fuktighet. Hele innholdet i blandingen skal brukes umiddelbart etter tilberedning. Tilberedning av en konsentrert saltoppløsning anbefales ikke, da det kan dannes utfellinger. Sterilisering ved hjelp av filtrering (0,22 μm filter) kan utføres hvis cellene skal dyrkes etter analyse. Forbered enzymatisk fordøyelsesløsning i et konisk rør på 15 ml ved å legge til anbefalte volumer og mengder for hver komponent (tabell 2). Tilsett natriumtyridoppløsning på opptil 2,5 ml. Vortex grundig for å oppløse.MERK: Papain er en sulfhydryl protease fra Carica papaya latex. Papain har bred spesifisitet, og det vil forringe de fleste proteinsnedsler9. Papain har vist seg mindre skadelig og mer effektiv enn andre proteaser i celledissosiasjonsprotokoller10. Vi gir detaljer om de fire dissosiasjonsprotokollene i tabell 2; vi observerte protokoll § 3 for å støtte høyest levedyktighet (93 %) av celle suspensjoner utarbeidet fra museblæren. Dissosiasjonsprosedyre og fremstilling av cellesuspensjon Samle blæren fra mus etter perfusjon. Punkter blæren for å frigjøre innhold, hvis noen. Tilsett 100 μL Tyrodes oppløsning i et tomt sentrifugerør og tjære på 1,5 ml. Plasser blæren i røret og vei igjen for å bestemme en nøyaktig blærevekt. Legg blæren på en 10 cm petriskål på is og tilsett 100 μL tyrodes løsning for hakking. Bruk kirurgisk saks, kutt stykker så små som mulig samtidig som hakketiden minimeres til ikke mer enn 2 \\ u20123 min per blære. Hvis pooling blærevev fra flere dyr, hakke blærene på en gang. Overfør hakket blærevev ved hjelp av en bredbar pipetspiss til 2,5 ml fordøyelsesbuffer for hver blære. Juster volumet hvis flere blærer er samlet. Inkuber vevet i fordøyelsesoppløsningen ved 37 °C i en inkubator på en nutatormikser i 40 min. På slutten av inkubasjonsperioden fjerner du fordøyelsesrøret fra inkubatoren. Triturat (pipet opp og ned) fordøyelsesløsning ved hjelp av en 5 ml pipette i 1 min. Sentrifuge i 10 min ved 350 x g ved 4 °C. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 1 ml celleavløsning. Plasser i en 37 °C inkubator på nutator mikseren i 10 min. Sentrifuge i 10 min ved 350 x g ved 4 °C. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 1 ml RBC lysis buffer (1x). Inkuber i 1 min. Legg til 9 ml PBS for å fortynne RBC-bufferen og stoppe RBC-lysisen. Send celler gjennom 70 μm cellesil i 50 ml konisk rør, ved hjelp av stempelet fra en sprøyte for å skrape cellesilen lett for å sikre full cellepassasje. Pass på å samle væsken som passerer gjennom silen, men kan bli fanget på undersiden av silen. Sentrifuge i 10 min ved 350 x g ved 4 °C. Fjern den overnaturlige og resuspend pellet i 200 μL cellefarging buffer (PBS med 2% FBS). Tell cellene. Immunolabeling av spesifikke celler for strømningscytometriMERK: For å oppdage ulike typer celler i blæren, designet vi et multi-farge flyt cytometri panel. For å utføre kompensasjon og utarbeide en passende gating strategi, inkluderer vi uopphetet og fluorescens minus en (FMO) kontroller. FMO-kontroller er viktige for å gate positiv befolkning, spesielt når den positive fraksjonen er svak. Fargeprosedyren er som følger. Blokkerer FcγRII/III reseptorer på cellerMERK: Vi anbefaler å blokkere uspesifikk binding av monoklonale antistoffer ved pre-inkubasjon av celler med monoklonale anti-Fc reseptorantistoffer, eller rekombinant Fc protein. Vask cellene ved sentrifugering ved 350 x g i 5 min ved 4 °C og tilsett cellefargingsbuffer. Kast overnaturlige og blokker FcγRII/III reseptorer på celler for å forhindre ikke-spesifikk antistofffarging ved å legge til CD16- og CD32-antistoffer i cellefargingsbuffer ved fortynning av 1:100. Inkuber på is i 10 min.MERK: Det er ikke nødvendig å vaske cellene; celler kan farges direkte etter dette stadiet. Farging for FMOerMERK: En Fluorescens Minus One (FMO) kontroll er et rør av alle fluorokromer som brukes i eksperimentet som inneholder alle fluorokromene unntatt en. Hvis man for eksempel har 4 forskjellige fluorokromer (A, B C og D + Annexin V og propidiumjodid (PI)), klargjør FMO-rørene som følger. FMO Tube 1: Antistoffer konjugert med B, C, D fluorokromer + (Annexin V og PI); FMO Tube 2: Antistoffer konjugert med A, C, D fluorokromer + (Annexin V og PI); FMO Tube 3: Antistoffer konjugert med A, B, C fluorokromer + (Annexin V og PI); FMO Tube 4: Antistoffer konjugert med A, B, C, D fluorokromer + (Annexin V); FMO Tube 5: Antistoffer konjugert med A, B, C, D fluorokromer + (PI). Vurder arten av det konjugerte fluorokromet for Annexin V-antistoffet. Farging av blokkerte celler med ønskede antistoffer Inkuber blokkerte celler med passende masterblandinger av fluoroforkonjugerte antistoffer mot de ønskede proteinene i 20 min på is beskyttet mot lys. Husk å inkludere FMOer. Vask celler med 1 ml cellefargingsbuffer tilsatt på hvert rør og sentrifuger igjen ved 350 x g i 5 min ved 10 °C. Kast den overnaturlige og resuspend cellepellet i 200 μL cellefarging buffer. Oppbevares på is til fluorescensdata kan innhentes ved hjelp av et strømningssytometer. Påfør Annexin V/ PI flekk. Forbered en arbeidsløsning av PI (100 μg/ml) i 1x Annexin-bindingsbuffer som beskrevet i produsentens protokoll for apoptosesettet for død celle. Bestem celletettheten, og noter bufferen og volumet de er lagret i. Sentrifugeprøver ved 350 x g i 5 min, kast de supernatante og gjenopplivingscellene i 1x Annexin-bindingsbuffer til en tetthet på ~ 1 x 106 celler / ml i et volum på 100 μL. Tilsett FITC-Annexin V (5 μL) og PI-arbeidsløsning (1 μL) i hver prøve (100 μL), som beskrevet i produsentens protokoll, og inkuber ved romtemperatur i 15 min. Tilsett 400 μL 1x Annexin-binding buffer til prøver, bland ved inversjon og hold på is til strømningscytometri. FACS-kalibrering Strømningscytometri og renhetskontroll Start flytcytmetrianalysen ved å måle de uoppfylte cellene for å avgrense cellemorfologi og fluorokromenes trau. Juster sidespavet (SSC) og fremoverspaving (FSC) ved å endre spenningene til hver fluorescensparameter. Mål fluorescensutslippet ved 530 nm (Annexin V) og >575 nm (PI). Definer den negative populasjonen i det første tiåret ved hjelp av rutenettene på hvert punktplott. Plasser hver FMO-kontroll i cytometeret og korriger spektral overlapping til de negative og positive populasjonsmedianene er justert. Mål 100 000 hendelser. Mål celler farget med bestemte markører og lag porter for cellepopulasjoner av interesse. Dataanalyse Samle inn dataene fra strømningssytometeret. Åpne programvaren for å visualisere arbeidsområdet for analyse. Opprette et arbeidsområde Importer FCS-filer ved å dra dem inn i arbeidsområdet. Filer vil være synlige i eksempel- og gruppedelen av arbeidsområdet. Dobbeltklikk i eksempelnavnet for å åpne filen. Bruk sidesppunktområdet (SSC-A) for y-aksen og fremover punktområdet (FSC-A) for x-aksen (figur 3A). Klikk på ikonet for polygon gating. Opprett en port rundt cellepopulasjonen av interesse i prikkplottet ved å klikke for å lage en portnode og fortsett deretter å klikke rundt cellepopulasjonen til den er fullført; dobbeltklikk for å lukke porten. Navngi porten i henhold til populasjonen fanget (f.eks., “Alle celler”) og klikk OK.MERK: Dobbeltklikk i porten “Alle celler” vil åpne et nytt grafvindu som bare viser hendelsene i “Alle celler”. Juster y-aksen for det nye punktplottet til SSC-H (sidepunkthøyde) ved å klikke i den svarte pilen og velge for å endre y-aksen.MERK: Denne porten for enkeltceller (singleter) og utelukker dobler eller større aggregater (figur 3B). Siden enkeltceller har proporsjonal bredde og lengde, bør de representeres som en populasjon på diagonalen. Celler som faller utenfor denne diagonale porten er dobler eller større aggregater. Dobbeltklikk på porten for å analysere nekrotiske (PI-positive), tidlig apoptotisk (Annexin V-positiv, PI-negativ) og sen apoptotisk (Annexin V-positive, PI-negative) celler (Figur 3C). Merk x-aksen som Annexin V og y-aksen som PI.MERK: I noen tilfeller, der signalintensiteten er lav, kan cellepopulasjoner synes å ha negative fluorescensverdier, som følge av korreksjon for bakgrunn. I dette tilfellet anbefales det å utføre en to-eksponentiell transformasjon. For å gjøre dette, klikk på T ved siden av y-aksen og velg Tilpass akse. I det nye vinduet endrer du skalaen til bi eksponentiell (Biex), legger til negative verdier i aksene ved å øke breddegrunnlaget og klikke Bruk. Dette vil forbedre oppløsningen av hendelser med lav signalintensitet. Vis data som et opptellingsplott. Bruk Kategorien Tilvalg rett under x-aksen, og velg tellerplott fra menyen. Tegn en Quat gate på tomten for å definere 4 diskrete målpopulasjoner. Klikk øverst i vinduet for å åpne redigeringsprogrammet for oppsett ved å klikke i Redigeringsprogram for oppsett og dra populasjoner inn i hvert enkelt område. Plasser plott i redigeringsprogrammet for oppsett ved å dra og slippe populasjoner fra arbeidsområdet til oppsettredigeringsvinduet. Visualisere ved hjelp av histogrammer Velg histogrammet fra Alternativer-fanen. Påfør en port for å velge Annexin V-positive celler; alternativt kan positive og negative populasjoner defineres ved hjelp av bisectorverktøyet. Eksempeldelen må nå vise de ulike populasjonene som er skjema og hierarkiet. Hvis du vil sammenligne eksempler, drar du alle histogrammene oppå hverandre. høyreklikk på histogrammet og fra histogrammet velg Forskjøvet Offset. Legge til statistiske analyser Åpne kategorien Statistikk ved å dobbeltklikke på populasjonen av interesse. Velg funksjonen som skal brukes, og parameteren som er involvert. Gjenta med andre populasjoner, ved å dra Sigma-ikonet inn i befolkningsnavnet. Bruk analysen på alle eksemplene ved å velge gating-strategien fra utvalget av interesse og dra den inn i gruppen som er definert av interessemarkøren, for eksempel Annexin V. Lag porter i FMO-kontrollprøvene og definer negative og positive populasjoner; denne gating strategien vil bli brukt på hele eksperimentet (Figur 3D \\ u2012F).MERK: Kontroller hver prøve individuelt for å sikre at gating er riktig og endre der det er nødvendig. Hvis celler har blitt farget med markørantistoff (f.eks. CD45), bruk tilsvarende FMO og port tilsvarende. Hvis du vil eksportere oppsettet, klikker du fil | Eksportere | Velg filformat (f.eks. jpg, pdf). Klikk Opprett tabell for å åpne et vindu med den endelige versjonen av tabellen. Eksporter tabellen ved å velge fil | Lagre som | Filnavn.

Representative Results

Kirurgisk prosedyreSuksessen til thorax ryggmargstranseksjon bestemmes ved vurdering av en rekke parametere, hvorav den mest åpenbare er hindlimb lammelse. Dyret beveger seg bare ved hjelp av forbenene, og drar baklimbs. Ellers aktivitetsnivåer, inkludert fôring, grooming og årvåkenhet er vanligvis normalt. I tillegg mister dyr volitional blærekontroll som resulterer i behovet for manuell blæreuttrykk av utprøveren hver 12. Etter eutanasi, ytterligere tegn på suksessen til skaden er først og fremst knyttet til økningen i blære-til-kroppsvekt forholdet, indikerer vev remodeling. Histologisk analyse avslører hyperplasi i både urothelial og glatt muskelrom3. Utarbeidelse av enkeltcellesuspensjonVed hjelp av offentlig tilgjengelige uttrykksdata ble berikelsen av blærevev for ekstracellulære matriseproteiner bestemt (figur 2) og brukes til å informere formuleringen av fordøyelsesblandingen. Siden kollagen er viktige komponenter i blæreveggen11,12, forsøkte vi først å bestemme de mest tallrike kollagen(e) i museblæren ved hjelp av RNA profilering datasett generert av Mouse ENCODE-prosjektet13. Vår analyse viste at kollagen 1A1, kollagen 3A1, kollagen 1A2 og kollagen 6A1 er mest rikelig kollagentyper i museblæren (Figur 2A). Vi brukte også Tabula Muris (et kompendium av encellede transkripsjonsdata fra mus (Mus musculus))8 for å bestemme mRNA-uttrykksnivået for kollagen 1, 3, 6 og hyaluronan. Dataene tillater direkte og kontrollert sammenligning av genuttrykk i celletyper som deles mellom vev. Denne analysen viste at uttrykket for disse ekstracellulære matrisekomponentene er mer utbredt i de mesenchymale celletypene i stedet for urothelium (figur 2B). Effekt av dissosiasjon på levedyktigheten til isolerte celler fra blærenFlow cytometri analyse viste at enzymatisk fordøyelse ved hjelp av 4 forskjellige protokoller ga levedyktighet på 83%, 86%, 93% eller 90%, henholdsvis. Dermed ble protokoll § 3 ansett som mest verdifull for bevaring av celle levedyktighet. Vi observerte også at ca. 4 % av cellene var nekrotiske (PI+/Annexin V-) (figur 4A). Disse observasjonene understreker effektiviteten av fordøyelsesprotokollen og den påfølgende fordelen på celle levedyktighet. Effekt av ryggmargsskade på ulike populasjoner av celler i blærenVi observerte en signifikant økning i det totale cellenummeret i blærer av SCI-mus sammenlignet med kontroller. Mønsteret av prikkplottene hentet fra SCI-blærer var også litt annerledes i samsvar med pågående organombygging på grunn av ryggmargsskade (figur 4B: første kolonne). Sammenlignet med kontroller viste blærene fra SCI-dyr en betydelig økning i CD45-positive celler. Figur 1: Representativ perfusjonsfullføring med redusert farge på leveren. (A) Demonstrerer leverfargen i begynnelsen av perfusjonen. (B) Viser den lette leverfargen på slutten av perfusjonen. Musen i (A) hadde ryggmargstranseksjon to uker før perfusjon som resulterte i blærehypertrofi og fremspringet ut av bekkenet i motsetning til musen i (B) som ikke hadde ryggmargsskade; i dette tilfellet blæren er liten og skjult i bekkenet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Transkripsjonsuttrykk av ekstracellulære matrisekomponenter (ECM) i museblæren. (A) Stolpediagram med 43 forskjellige kollagentyper. Uttrykket er angitt av Reads Per Kilobase av transkripsjon, per million tilordnede leser (RPKM) (data samles inn fra BioProject: PRJNA66167)14. (B)Fiolinplott av genuttrykk i celletyper hentet fra mikrofluidisk dråpebasert 3′-end telling i en pool av mannlige og kvinnelige dissosierte urinblæreprøver (mannlige og kvinner). Antall ble logg normalisert for hver celle ved hjelp av den naturlige logaritmen på 1 + tellinger per million ln (CPM + 1)8. En pseudocount av 1 CPM ble lagt til før du tar logaritmer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Gating strategi og FMO kontroller for å bestemme fluorescens spredning. (A) Valg av cellepopulasjon. (B) Gating strategi for singlets. (C) Gating for nekrotiske, og tidlige og sene apoptotiske celler ved hjelp av PI og Annexin V antistoff. (D\u2012F) En skjematisk prikk plott av flerfarget flyt cytometri (f.eks, antistoffer konjugert med A, B, C, D fluorokromer + (Annexin V og PI). Dette viser fluorescensen spredt inn i antistoffet med fluorokrom En kanal vist av FMO-kontrollen sammenlignet med en uopphetet kontroll. Oransje stiplet linje representerer FMO gating grensen sammenlignet med uopphetet grense i rødt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Strømningscytometri av forskjellige celletyper i blæren. (A)Annexin V / PI dobbel farging flytdiagrammer. De forskjellige kombinasjonene av enzymer og kjemikalier som brukes for hver protokoll er representert foran det tilsvarende levedyktighetsplottet. Disse dataene viser at høyeste levedyktighet ble oppnådd med protokoll avsnitt 3. (B) Representative histogrammer som illustrerer intensiteten av Ly-6A/E (Sca-1) og CD326 (Ep-CAM) som oppdages i enkeltkanaler. (C) Effekten av SCI på cellepopulasjonen av museblæren. Øvre panel viser resultatene av farging på tre dissosierte blærer hentet fra kontroll ikke-kirurgiske mus og nedre panel viser resultatene av farging på tre dyr med SCI. Den første kolonnen er den totale cellepopulasjonen. Den andre kolonnen viser valget for singlet gating. Den tredje kolonnen viser underpopulasjonen av levende celler som er negative for B-celler, T-celler og NK-celler. Den fjerde kolonnen viser fargingen for levende celler som er positive for CD45. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Komponent Beløp (for 500 ml) Molaritet Nacl 4.091 g 140 mM KCl (andre 0.186 g 5 mM (andre personer) MgCl2 Leilighet 0.0476 g 1 mM (andre personer) D-glukose 0.9 g 10 mM HEPES 1.19 g 10 mM Tabell 1: Komponenter for fremstilling av Tyrodes oppløsning. De angitte komponentene er til fremstilling av 500 ml Tyrodes oppløsning. Komponent Beløpet Protokoll seksjon 1 Protokoll seksjon 2 Protokoll seksjon 3 Protokoll seksjon 4 Bsa 5 mg Ja Ja Ja Ja CaCl2 Leilighet 0,03 mM Ja Ja Ja Ja Kollagenase Type I 132,5 enheter Ja Ja Ja Ja Kollagennase Type III 96,4 enheter Ja Ja Ja Ja Kollagnase Type VI 50 enheter – – Ja – DNase 10 enheter Ja Ja Ja – Papain 115 enheter – – Ja Ja Pan Collagenase 50 enheter – – Ja Ja Hyaluronidase 10,5 enheter – – Ja Ja Dispase II 1.25 enheter Ja Ja – – Celledissosiasjonsløsning 1 ml Ja – Ja – Rekombinant enzym 1 ml – Ja – Ja Tabell 2: Komponenter for fremstilling av fordøyelsesbuffer. De angitte komponentene er for fremstilling av 2,5 ml fordøyelsesblanding (1 U katalyserer hydrolysen på 1 μmol substrat per minutt ved 37 °C. Se produktdatabladet for definisjon av enhet av hvert enzym).

Discussion

Musen ryggmargsskade modellen beskrevet her gir en reproduserbar metode for å skape en funksjonell blære utløp obstruksjon på grunn av tap av koordinering mellom blæren sammentrekning og ekstern uretral sphincter avslapning. Dette i sin tur fremkaller dyp ombygging av blæreveggen så tidlig som 2 uker etter skade preget av utvidelse av urothelial og glatte muskelrom. Kritiske skritt i gjennomføringen av SCI-modellen hos gnagere inkluderer (i) streng oppmerksomhet til manuelt blæreuttrykk i perioden med ryggmargssjokk som følger i 10\u201214 dager etter skade; (ii) ernæringsmessig berikelse for å minimere vekttap; og (iii) reduksjon av potensialet for urinskålding spesielt for eksperimenter som strekker seg utover retur av refleks annullering. Begrensninger av modellen inkluderer potensialet for uretral okklusjon hos mus fra blodpropper i løpet av forbigående hematuri, og i tillegg hos hannmus fra sædkoagulum etter retrograd ejakulasjon etter operasjonen.

Vevdissosiasjonstilnærmingen beskrevet her illustrerer viktigheten av å vurdere strukturelle endringer i vev som oppstår fra den eksperimentelle fornærmelsen, i dette tilfellet betydelig vevombygging etter SCI som kan påvirke nedstrøms analyser. Med økningen i enkeltcelleanalyser er det avgjørende å sikre at forskjeller observert i genuttrykk ikke bare er et resultat av dissosiasjonsinduserte perturbasjoner, men er virkelig representative for underliggende biologiske endringer som er relevante for sykdomsmodellen. Bruken av offentlig tilgjengelige uttrykksdata tillot oss å endre formuleringen av fordøyelsesbuffere for å sikre effektiv fordøyelse av ekstracellulær matrise samtidig som levedyktigheten maksimeres. Ytterligere modifikasjoner som kan vurderes i fremtidige applikasjoner inkluderer tillegg av actinomycin D, for å stoppe transkripsjon av umiddelbare tidlige gener som er følsomme for dissosiasjonsprotokollen¹⁵.

Pipetteringsteknikk er avgjørende når de dissosierer vev eller overfører celler som allerede er i suspensjon. For å redusere fysisk skade på celler fra skjærkrefter, er det viktig å pipette forsiktig og sakte under celleususpensjon. Det anbefales vanligvis å bruke pipettespisser med bred boring. Hvis du bruker standardspisser, er det spesielt viktig å pipettecellesuspensjoner forsiktig for å unngå skjærkrefter som ellers ville skade celler. Bruk av cellesiler er uunngåelig i denne protokollen, men cellekonsentrasjonen kan avta med 20% eller mer, ledsaget av et volumtap på 100 μL eller mer. Vi anbefaler at cellekonsentrasjon bestemmes etter anstrenging for å sikre et nøyaktig celleantall.

I strømningscytometri gir FMO-kontroller et mål på bakgrunn på grunn av lufting av signal fra overlappende utslippstopp. De er ikke et mål på ikke-spesifikk antistoffbinding, eller bakgrunnsfarging som kan være til stede når et antistoff er inkludert i den kanalen. For å ta høyde for den ikke-spesifikke antistoffbindingen må man inkludere passende isotypekontroller; for bakgrunnsfarging, må man inkludere negative kontroller. Samlet sikrer disse kontrollene nøyaktig måling av cellepopulasjoner.

Materials

2.5 X Magnifying Loupes
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle	ETHICON	J546
70 μm Cell Strainer	Thermofisher	22363548
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA	Millipore	SCR005
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL)	VWR	89049-168
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	118213
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11	BD Biosciences	564590
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5172	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Bovine Serum Albumin	Sigma	A9647-100G
CaCl2	Sigma	2115-250ML
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-6412	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue	Biorad	1450003
Cell Staining Buffer	BioLegend	420201
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma	C0130-1G
Collagenase Type I	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
Collagenase Type III	Worthington Biochemical Corporation	LS004182
Collagenase, Type 6	Worthington Biochemical Corporation	LS005319
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI)	Thermofisher	V13241
Dispase II	Sigma	D4693-1G
DNase	Sigma	DN25-1G
Enrofloxacin (Baytril)	Bayer Health Care LLC,	NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP	2.27% Injectable Solution
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352096
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	352070
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	122505
Hyaluronidase from sheep testes, Type II	Sigma	H2126
MACS SmartStrainers (100 µm)	Miltenyi Biotec, Inc.	130-110-917
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.	RS-5630	ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD
Meloxicam	Patterson Veterinary	07-891-7959
Papain	Worthington Biochemical Corporation	LS003119
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	115509	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified	BioLegend	100309	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	100409	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	100709	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified	BioLegend	108715	Dump Channel
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified	BioLegend	116209	Dump Channel
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2	BD Biosciences	553141
RBC Lysis Buffer (10X)	BioLegend	420301
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x	Biolegend	420201
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml	VWR	89004-290
TC20 Automated Cell Counter	Biorad	1450102
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)	Patterson Veterinary	07-893-7216	skin protectant
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red	Thermofisher	A1217701
Vetropolycin eye ointment	Dechra Veterinary Products	NADA # 065-016. Approved by FDA.	protect eyes during anesthesia