Målet med denne protokollen er å bruke en optimalisert vevdissosiasjonsprotokoll til en musemodell av ryggmargsskade og validere tilnærmingen for enkeltcelleanalyse ved flytcytometri.
Vi beskriver implementeringen av ryggmargsskade hos mus for å fremkalle detrusor-sphincter dyssynergia, en funksjonell blæreutløpsobstruksjon og påfølgende blærevegg ombygging. For å lette vurderingen av blæreveggens cellulære sammensetning i ikke-skadet kontroll og ryggmargsskadede mus, utviklet vi en optimalisert dissosiasjonsprotokoll som støtter høy cellelevelighet og muliggjør påvisning av diskrete underpopulasjoner ved strømningscytometri.
Ryggmargsskade er skapt ved fullstendig transeksjon av thorax ryggmargen. På tidspunktet for vevshøsting er dyret gjennomsyret av fosfatbufret saltvann under dypbedøvelse og blærer høstes inn i Tyrodes buffer. Vev er hakket før inkubasjon i fordøyelsesbufferen som er optimalisert basert på kollageninnholdet i museblæren som bestemmes av avhør av offentlig tilgjengelige genuttrykksdatabaser. Etter generering av en enkeltcellesuspensjon analyseres materialet ved strømningscytometri for vurdering av cellelevbarhet, cellenummer og spesifikke underpopulasjoner. Vi viser at metoden gir cellepopulasjoner med større enn 90% levedyktighet, og robust representasjon av celler av mesenchymal og epitelopprinnelse. Denne metoden vil muliggjøre nøyaktig nedstrøms analyse av diskrete celletyper i museblæren og potensielt andre organer.
Perturbasjoner av normal urinblærefunksjon kan føre til redusert livskvalitet for mange individer. For å få en bedre forståelse av hvordan skade eller sykdom avsporer normal blærefunksjon, er det viktig å undersøke den normale biologiske tilstanden til celler i blæren og hvordan de endres under eksperimentell perturbasjon. Til dags dato har imidlertid de spesifikke cellepopulasjonene som bor i urinblæren, og hvordan de endres med skade, blitt ufullstendig preget.
Encelleprofileringsmetoder som strømningscytometri eller enkeltcellede RNA-sekvensering (scRNA-seq) har potensial til å kaste lys over bestemte celletyper i blæren. Men for at disse tilnærmingene skal være informativt vev må fordøyes på en måte som ikke påvirker levedyktighet, genuttrykk og representative cellepopulasjonsprosenter av høstet vev. Protokoller som benytter enzymatisk disaggregation kan påvirke overflaten markør uttrykk gjennom ukritisk protease aktivitet1, og dermed påvirker celleidentifikasjon ved flyt cytometri, mens dissosiasjonsprosessen i seg selv kan føre til induksjon av umiddelbare tidlige gener, som beskrevet nylig av Van den Brink og kolleger2. Forfatterne viste at selv om dissosiasjonsrammede underbefolkningen var liten, kunne det utløse et sterkt forurensende signal i bulkuttrykksstudier på grunn av de høye uttrykksnivåene av umiddelbare tidlige gener. I tillegg oppdaget varigheten av dissosiasjonsprotokollen bulkuttrykksnivåer av gener som viste seg å være unike for noen underpopulasjoner. Enkeltcelledatasett generert uten å ta hensyn til virkningen av dissosiasjonsprotokollen kan derfor gi genuttrykksendringer som oppstår fra dissosiasjonsmetoden, i motsetning til underliggende biologi. Disse observasjonene tyder på at publiserte encellede transkripsjonsdata bør tolkes med forsiktighet, og at resultatene skal valideres ved uavhengige metoder.
Selv om harde og lange dissosiasjonsmetoder kan endre genuttrykket icellene 2; effektiv isolering av celler er avgjørende for å oppnå nøyaktig representasjon av celletypene som finnes. Siden blæren er et komplekst organ bestående av flere celletyper, kan noen populasjoner som urotheliale eller stromale celler være relativt underrepresentert, mens andre celletyper som fibroblaster finnes innenfor ekstracellulær matrise og kan være utfordrende å isolere. Dissosiasjon blir enda mer utfordrende hvis blæren har gjennomgått betydelig ombygging og fibrose som det observert i ryggmargsskade3,4 eller blæreutløp obstruksjon5,6.
Her beskriver vi en optimalisert vevdissosiasjonsmetode for nedstrøms enkeltcelleanalyse i ryggmargen skadet museblæren. Ved hjelp av strømningscytometri sammenlignet vi fire enzymatiske fordøyelsesprotokoller for deres evne til å gi en enkelt cellesuspensjon, støtte celle levedyktighet og opprettholde riktig andel av cellepopulasjoner. Basert på denne analysen konkluderer vi med at å minimere celledød, cellulære aggregater, ikke-cellulære nukleinsyrer og potensielle hemmere av nedstrømsanalyse er avgjørende for å oppnå data av høy kvalitet.
Musen ryggmargsskade modellen beskrevet her gir en reproduserbar metode for å skape en funksjonell blære utløp obstruksjon på grunn av tap av koordinering mellom blæren sammentrekning og ekstern uretral sphincter avslapning. Dette i sin tur fremkaller dyp ombygging av blæreveggen så tidlig som 2 uker etter skade preget av utvidelse av urothelial og glatte muskelrom. Kritiske skritt i gjennomføringen av SCI-modellen hos gnagere inkluderer (i) streng oppmerksomhet til manuelt blæreuttrykk i perioden med ryggmargssjokk som følger i 10\u201214 dager etter skade; (ii) ernæringsmessig berikelse for å minimere vekttap; og (iii) reduksjon av potensialet for urinskålding spesielt for eksperimenter som strekker seg utover retur av refleks annullering. Begrensninger av modellen inkluderer potensialet for uretral okklusjon hos mus fra blodpropper i løpet av forbigående hematuri, og i tillegg hos hannmus fra sædkoagulum etter retrograd ejakulasjon etter operasjonen.
Vevdissosiasjonstilnærmingen beskrevet her illustrerer viktigheten av å vurdere strukturelle endringer i vev som oppstår fra den eksperimentelle fornærmelsen, i dette tilfellet betydelig vevombygging etter SCI som kan påvirke nedstrøms analyser. Med økningen i enkeltcelleanalyser er det avgjørende å sikre at forskjeller observert i genuttrykk ikke bare er et resultat av dissosiasjonsinduserte perturbasjoner, men er virkelig representative for underliggende biologiske endringer som er relevante for sykdomsmodellen. Bruken av offentlig tilgjengelige uttrykksdata tillot oss å endre formuleringen av fordøyelsesbuffere for å sikre effektiv fordøyelse av ekstracellulær matrise samtidig som levedyktigheten maksimeres. Ytterligere modifikasjoner som kan vurderes i fremtidige applikasjoner inkluderer tillegg av actinomycin D, for å stoppe transkripsjon av umiddelbare tidlige gener som er følsomme for dissosiasjonsprotokollen15.
Pipetteringsteknikk er avgjørende når de dissosierer vev eller overfører celler som allerede er i suspensjon. For å redusere fysisk skade på celler fra skjærkrefter, er det viktig å pipette forsiktig og sakte under celleususpensjon. Det anbefales vanligvis å bruke pipettespisser med bred boring. Hvis du bruker standardspisser, er det spesielt viktig å pipettecellesuspensjoner forsiktig for å unngå skjærkrefter som ellers ville skade celler. Bruk av cellesiler er uunngåelig i denne protokollen, men cellekonsentrasjonen kan avta med 20% eller mer, ledsaget av et volumtap på 100 μL eller mer. Vi anbefaler at cellekonsentrasjon bestemmes etter anstrenging for å sikre et nøyaktig celleantall.
I strømningscytometri gir FMO-kontroller et mål på bakgrunn på grunn av lufting av signal fra overlappende utslippstopp. De er ikke et mål på ikke-spesifikk antistoffbinding, eller bakgrunnsfarging som kan være til stede når et antistoff er inkludert i den kanalen. For å ta høyde for den ikke-spesifikke antistoffbindingen må man inkludere passende isotypekontroller; for bakgrunnsfarging, må man inkludere negative kontroller. Samlet sikrer disse kontrollene nøyaktig måling av cellepopulasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (R01 DK077195 til R.M.A, R01 DK104641 til R.M.A og D.R.B). Vi anerkjenner verdifulle innspill fra Dr. Stuart Orkin i avdelingen for hematologi / onkologi, Boston Children’s Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School og Dana-Farber Cancer Institute. Vi anerkjenner også støtte fra Kyle Costa i postoperativ omsorg for mus, Mary Taglienti og Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School) for teknisk assistanse og nyttige diskusjoner.
2.5 X Magnifying Loupes | |||
7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle | ETHICON | J546 | |
70 μm Cell Strainer | Thermofisher | 22363548 | |
Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA | Millipore | SCR005 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 µL) | VWR | 89049-168 | |
APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 118213 | |
BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 30-F11 | BD Biosciences | 564590 | |
BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1×2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5172 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647-100G | |
CaCl2 | Sigma | 2115-250ML | |
CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-6412 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue | Biorad | 1450003 | |
Cell Staining Buffer | BioLegend | 420201 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
Collagenase Type I | Worthington Biochemical Corporation | LS004196 | |
Collagenase Type III | Worthington Biochemical Corporation | LS004182 | |
Collagenase, Type 6 | Worthington Biochemical Corporation | LS005319 | |
Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 & Propidium Iodide (PI) | Thermofisher | V13241 | |
Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
DNase | Sigma | DN25-1G | |
Enrofloxacin (Baytril) | Bayer Health Care LLC, | NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP | 2.27% Injectable Solution |
Falcon 15 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352096 | |
Falcon 50 ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 352070 | |
FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 122505 | |
Hyaluronidase from sheep testes, Type II | Sigma | H2126 | |
MACS SmartStrainers (100 µm) | Miltenyi Biotec, Inc. | 130-110-917 | |
McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc. | RS-5630 | ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD |
Meloxicam | Patterson Veterinary | 07-891-7959 | |
Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003119 | |
PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 115509 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD3ε Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified | BioLegend | 100309 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 100409 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 100709 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, κ, affinity purified | BioLegend | 108715 | Dump Channel |
PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, κ, affinity purified | BioLegend | 116209 | Dump Channel |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, κ, Clone 2.4G2 | BD Biosciences | 553141 | |
RBC Lysis Buffer (10X) | BioLegend | 420301 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer 1x | Biolegend | 420201 | |
Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml | VWR | 89004-290 | |
TC20 Automated Cell Counter | Biorad | 1450102 | |
Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin) | Patterson Veterinary | 07-893-7216 | skin protectant |
TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red | Thermofisher | A1217701 | |
Vetropolycin eye ointment | Dechra Veterinary Products | NADA # 065-016. Approved by FDA. | protect eyes during anesthesia |