Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

حاوية الجرافين من خلايا الثدييات الثابتة كيميائياً للمجهر الإلكتروني للمرحلة السائلة

Published: September 21, 2020 doi: 10.3791/61458
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1INM-Leibniz Institute for New Materials, 2Department of Physics, Saarland University

Summary

هنا هو بروتوكول لوضع العلامات البروتينات الغشاء في خلايا الثدييات وطلاء العينة مع الجرافين للمرحلة السائلة المسح المجهري الإلكترون الإرسال. الاستقرار من العينات ضدّ الضرر يسبّب بالإشعاع يستطيع أيضا درست مع هذا بروتوكول.

Abstract

يتم وصف بروتوكول للتحقيق في مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية 2 (HER2) في غشاء البلازما السليمة لخلايا سرطان الثدي باستخدام المجهر الإلكتروني للمسح الضوئي للإرسال (STEM). نمت خلايا من الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 على رقائق السيليكون مع نيتريد السيليكون (SiN) النوافذ. كانت الخلايا ثابتة كيميائيا، و وصفت بروتينات HER2 مع الجسيمات النانوية نقطة الكم (QDs)، وذلك باستخدام بروتوكول ملزم البيوتين streptavidin على مرحلتين. كانت الخلايا مغلفة بالجرافين متعدد الطبقات للحفاظ على حالة رطبة ، وحمايتها من تلف شعاع الإلكترون خلال STEM. لفحص استقرار العينات تحت إشعاع الشعاع الإلكتروني، تم إجراء تجربة سلسلة جرعات. تمت مقارنة العينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. شعاع الضرر الناجم، في شكل التحف مشرق، ظهرت لبعض العينات غير المغلفة في زيادة جرعة الإلكترون D،في حين لم تظهر أي قطع أثرية على عينات المغلفة.

Introduction

تحليل وظيفة البروتين الغشاء ضروري للبحوث البيولوجية الخلية، وتطوير المخدرات. تتضمن فئة من التجارب الهامة فحص مواضع البروتين الغشاء في الخلايا. ويمكن استخدام هذه المعلومات لاستنتاج استنتاجات حول تجميع البروتينات في مجمعات البروتين ومواقعها المحددة في غشاء البلازما، والتي، عن طريق التجميع الديناميكي والتفكيك، يدفع مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية. من بين التقنيات الأخرى، يتم استخدام المجهر الضوئي (LM) والمجهر الإلكتروني (EM) لدراسة وظائف البروتين في الخلايا. LM يسمح بتحليل الخلايا الكاملة في السائل; ومع ذلك ، يقتصر القرار على 200-300 نانومتر للتقليدية و 20 نانومتر للمجهر الفلوري فائقة القرار تحت الظروف العملية1،2. EM يوفر حوالي 1 Å القرارات3، ولكن إعداد العينة التقليدية يتطلب الجفاف ، تلطيخ المعادن لتعزيز التباين الصورة ، وتضمين في مادة متزايدة ، مثل الراتنج ، لنقل المجهر الإلكترون (TEM)4. للحفاظ على العينات البيولوجية في بيئة تشبه أكثر من السكان الأصليين ، يمكن استخدام تقنيات cryo-EM5،6. يتم تجميد العينات بسرعة إلى جليد غير متبلور ، وإذا لزم الأمر ، يتم تقسيمها. خيار آخر هو تجميد كسر م7.

وقد ظهرت تقنيات EM لدراسة البروتينات الغشاء داخل الخلايا السليمة في وطنهم، والدولة السائلة في العقد الماضي8،9،10،11. تم تحقيق دقة مكانية من 2 نانومتر على نقطة الكم (QD) يسمى البروتينات الغشاء في الخلايا الكاملة التي تزرع على غشاء سي إن ومحاطة بطبقة من الجرافين9.

هنا، يتم وصف تفاصيل بروتوكول لوضع العلامات البروتين وطلاء الجرافين9،12. الهدف من هذا البروتوكول هو تحليل التوزيع المكاني لـ HER2 في غشاء الخلايا الثابتة الكاملة ، مع الحفاظ على الخلايا في حالة رطبة. طلاء مع الجرافين يمنع تجفيف الخلايا في فراغ، ويقلل أيضا من أضرار الإشعاع13. هذه الطريقة توفر معلومات حول البروتينات الغشاء المسمى داخل غشاء البلازما سليمة, ولكن الأسلوب ليست مفيدة لدراسة البنية الفائقة الخلوية كما هو الحال عادة مع EM.

الجرافين هو أنحف المواد النانوية المعروفة، ويتكون من ذرة كربون واحدة ورقة بلوري سميكة مرتبة في شعرية العسل14. لديها خصائص فريدة من نوعها بما في ذلك المرونة العالية والقوة الميكانيكية. وقد أظهرت الأبحاث الحديثة أن الجرافين الخالي من العيوب غير قابل للاختراق للغازات والسوائل ، ولكن العيوب تسمح بتغلغل الهيدروجين15. ويمكن تقليل هذا التسرب باستخدام الجرافين متعدد الطبقات كما هو مستخدم هنا. وقد أظهرت الجرافين Bilayer مؤخرا أن تكون مفيدة كدعم لعينات التبريد-EM، وتحسين تجانس طبقة الجليد رقيقة مقارنة أكسيد الجرافين حيث يمكن تشكيل طبقات غير متجانسة فقط16. كما تبين الجرافين للحد من تلف شعاع العينات البيولوجية أثناء مرحلة انتقال السائل المجهري الإلكترون13,17. كتجربة مثالية، HER2 أعرب عنها في الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 كان المسمى مع QDs18 وتوزيعها المكاني المسجلة باستخدام STEM. كانت الخلايا بذر على رقاقة Si مع غشاء سي إن شفاف إلكترون19. تم اختيار الرقائق الدقيقة كدعم لأنها قوية ، متوافقة مع LM و EM ، ويمكن إجراء وضع العلامات بالكامل مباشرة على رقاقة19. بعد مرفق الخلية، تم تسمية HER2 ببروتوكول20تسمية من خطوتين . أولاً، تم إرفاق مركب 21 من الأجسام المضادة للأجسام المضادة لـ HER2 المضادة للأجسام الحيوية21 بـ HER2. ثم تم إصلاح الخلايا كيميائيا لمنع التجمع مستقبلات التسمية الناجمة، وزيادة استقرار ultrastructure الخلوية. تم ربط QDs المغلفة بـ Streptavidin لاحقًا بمجمع imetic HER2-Anti أُسمتيك. سمحت إشارة الفلورس الساطعة والنوى الكثيفة بالإلكترونات من QDs بالمنظار الفلوري والإلكتروني (CLEM)20. CLEM مفيد بشكل خاص لأن المناطق الخلوية التي تهم تحليل STEM يمكن اختيارها من صور المجهر الفلوريس نظرة عامة تسليط الضوء على توطين HER2 على الخلايا. تم تحليل الخلايا عن طريق المجهر المفلور لتحديد المناطق الخلوية ذات مستويات HER2 عالية. بعد ذلك، تم نقل ورقة سميكة طبقة 3-5 من الجرافين على الخلايا للطلاء9،22. وفي وقت لاحق، تم تركيب العينة في حامل عينة EM. تم الحصول على بيانات STEM باستخدام كاشف الحقل الداكن الحلقي (ADF) ، مما يوفر معلومات حول التوزيع المكاني لـ HER2 على سطح الخلية بالنسبة لموقع سطح الخلية ، ولكن لم يعط أي معلومات حول البنية الفائقة للخلية. لتحديد استقرار العينة تحت إشعاع الشعاع الإلكتروني، تم فحص العينات بجرعة متزايدة(D)في سلسلة صور. تم التحقيق في الفرق بين العينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. تم تقييم عدة أنواع من الأضرار الإشعاعية.

البروتوكول الموصوف هنا يستخدم HER2 overexing الثدييات سرطان الثدي خلية خط SKBR3 كنظام نموذجي لاستهداف HER223. ويتضمن البروتوكول إعداد عينة واحدة مغلفة بالجرافين، وعينة واحدة مماثلة ولكن دون طلاء الجرافين للمقارنة. يتم إعداد التجربة في تكرار منذ نافذة SiN قد كسر مرة واحدة كل حين، والحصول على نسخة مكررة تجريبية في معظم الحالات. العائد العام للطريقة هو معنى عال أن رقائق مع الخلايا المغطاة الجرافين عادة ما يتم الحصول عليها مع خطأ استثنائي حتى ولو لم يكن يمكن تغطية نافذة سي إن بأكملها مع الجرافين في جميع الحالات. لم يتم وصف التكرارات في البروتوكول.

إن بروتوكول وضع العلامات (الخطوات 1-5) مشابه لبروتوكول وضع العلامات على مستقبلات عامل النمو البشرة في الخلايا الليفية COS7 التي نشرت سابقا24؛ ويشار إلى التفاصيل في تلك الورقة فيما يتعلق بمعالجة الرقائق الدقيقة، واستخدام ألواح البئر. تم تحسين البروتوكول التالي لوضع علامة على HER2 ، طلاء الجرافين9، وفحص تحمل الإشعاع للعينة.

Protocol

1. تنظيف الرقائق الدقيقة والطلاء مع بولي-L-ليسين (PLL) والبروتين الليفي الشبيه (FLP)

  1. ضع ورقتين من الرقائق الدقيقة مع غشاء SiN (2.0 × 2.6 مم) في 50 مل من الأسيتون. التعامل مع الرقائق الدقيقة بعناية مع الجانب المسطح التي تواجه ما يصل. تجنب كسر الحواف باستخدام ملاقط مسطحة منقار. تجنب لمس السطح العلوي من الرقائق الدقيقة عند التعامل مع ملاقط لمنع الكسر من نافذة SiN.
    ملاحظة: يمكن للمرء أيضا استخدام ملاقط متعددةtetrafluoroethylene المغلفة أو الكربون طرف لمنع تلف الرقائق الدقيقة.
  2. غسل رقائق لمدة 2 دقيقة عن طريق هز بعناية منقار، ومشاهدة رقائق لا الوجه أكثر.
  3. نقل الرقائق الدقيقة إلى 50 مل من الإيثانول وغسل لمدة 2 دقيقة عن طريق هز بعناية منقار. تأكد من أن نقل سريع بحيث لا الجافة الأسيتون الزائدة في.
  4. اغسل الرقائق الدقيقة مع 50 مل من الماء لمدة 10 دقائق.
  5. تراجع الرقائق الدقيقة في منقار أعدت حديثا من 20 مل من الإيثانول.
  6. ضع الرقائق على نسيج غرفة النظافة للتجفيف.
  7. البلازما تنظيف الرقائق مع 11.5 sccm O2 و 35 sccm Ar في 70 mTorr والترددات الراديوية (RF) - الهدف من 50 واط لمدة 5 دقائق.
  8. ضع الرقائق الدقيقة في غطاء تدفق رقائق لثلامينة لعمل الخلايا العقيمة.
  9. إعداد حل من 0.01٪ PLL في الماء. إعداد حل من 15 ميكروغرام / مل FLP في المالحة الفوسفات المخزنة (PBS).
  10. إعداد لوحة 24 جيدا تحت غطاء محرك التدفق لارينار وملء 5 آبار بشكل فردي مع 1 مل من الحلول بالترتيب التالي: حسنا 1 – PLL; بئر 2 – ماء; بئر 3 – ماء; حسنا 4 - FLP; كذلك 5 -- برنامج تلفزيوني وأيضا 6 -- برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: سلوك خطوات الغسيل عن طريق غمس رقاقة في 24 أو 96 يشار جيدا لبضع ثوان باستخدام ملاقط. تنفيذ خطوات الحضانة عن طريق احتضان الرقائق الدقيقة في بئر 24 أو 96 في الحل المشار إليه للوقت ودرجة الحرارة المشار إليها. نقل الرقائق الدقيقة إلى آخر جيدا في غضون ثوان قليلة.
  11. احتضان الرقائق الدقيقة في حل PLL لمدة 5 دقائق. ثم غسل الرقائق الدقيقة في الماء مرتين.
  12. احتضان الرقائق الدقيقة في FLP لمدة 5 دقائق. ثم غسل الرقائق الدقيقة في برنامج تلفزيوني مرتين.
  13. نقل كل من الرقائق الدقيقة إلى الآبار (واحد لكل رقاقة) من لوحة جديدة 96 جيدا شغلها مسبقا مع 50 ميكرولتر من مصل خال من المتوسطة لبذات الخلايا.
  14. احتضان الرقائق الدقيقة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 حتى يتم إعداد تعليق الخلية.

2. خلايا البذر على رقاقة غشاء SiN

  1. إعداد جميع الإمدادات والمعدات في غطاء تدفق المفارق لضمان العمل العقيمة.
  2. غسل سرطان الثدي خط الخلية، SKBR3، في قارورة ثقافة الخلية مع متوسط النمو مرة واحدة. استخدام متوسطة النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، و 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAAs) كوسيلة للنمو.
  3. احتضان الخلايا مع 1 مل من حل مفرزة الخلية حتى الخلايا منفصلة عن القارورة.
  4. إضافة 5 مل من متوسطة النمو إلى الخلايا المنفصلة في القارورة. نقل هذا التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي.
  5. ماصة 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في جهاز قياس الهيموسيت للحصول على تركيز الخلية. استخدم الصيغة التالية.
    Equation 1.
  6. إعداد تعليق خلية متفرقة من 2.5 × 105 خلايا / مل. حساب المبلغ المطلوب من تعليق الخلية المعدة من قبل:
    Equation 2
    وملء مع متوسطة النمو إلى وحدة التخزين المطلوبة.
  7. أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى بئرين من 96 بئراً تحتوي على رقائق دقيقة مغلفة من نوع PLL و FLP مع غشاء SiN مواجه للأعلى و50 ميكرولتراً من وسط خال من المصل بحيث يحتوي كل بئر على 25000 خلية.
  8. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 5 دقائق لانتظار الخلايا لإرفاق إلى رقاقة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن أن تنفصل الخلايا عن الرقاقة لأنها لم تلتزم بعد.
  9. تحقق من كثافة الخلايا على رقاقة مع مجهر مقلوب. تأكد من تغطية الخلايا النافذة بمساحة كافية لتسطيحها والتمسك بها (انظر الشكل 1A).
    ملاحظة: يمكن إضافة المزيد من الخلايا عند هذه النقطة إذا لزم الأمر.
  10. نقل الرقائق الدقيقة إلى آبار جديدة تحتوي على 200 ميكرولتر من متوسط النمو واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
  11. في فترة ما بعد الظهر من اليوم التالي، نقل كل من الرقائق الدقيقة إلى مصل خال من المتوسطة (مصل تجويع المتوسطة) إذا كانت الخلايا قد بالارض من وتلتزم التقاء فحص بصريا (أي، جزء من منطقة النافذة مغطاة بالخلايا) من حوالي 2/3 (انظر الشكل 1B). تغيير إلى مصل خال من المصل حسب الحاجة لجلب الخلايا في حالة بداية محددة حسب الحاجة للمقارنة بين التجارب المختلفة25.
  12. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يجب أن تدرك أن كميات الخلايا قد تختلف وفقاً لمعدلات النمو ومورفولوجيا الخلية للخطوط الخلية الأخرى.

3. HER2 وضع العلامات واللصلح

  1. إعداد الحلول كما هو موضح في الجدول التكميلي 1.
    1. العمل تحت غطاء محرك التدفق لاريمينر لضمان العمل العقيم. استخدام لوحة 96 جيدا يشار إليها باسم وضع العلامات لوحة أنا، وملء 6 آبار لكل رقاقة مع 200 ميكرولتر من وضع العلامات 1 الحلول: PBS / BSA، PBS/ BSA، الأجسام المضادة المحاكاة، PBS / BSA، PBS / BSA. استخدم صفًا واحدًا (حرف واحد لكل صف، على سبيل المثال، A1 إلى A6) من لوحة البئر لكل رقاقة. ادفأ لوحة الملصقات إلى 37 درجة مئوية.
    2. تحت غطاء محرك الدخان ، وإعداد لوحة 24 جيدا المشار إليها باسم لوحة التثبيت ، وملء 8 آبار لكل رقاقة مع 500 ميكرولتر من حلول لوحة التثبيت : CB ، FA ، CB ، PBS ، PBS ، PBS / الجليسين ، PBS / BSA.
      تنبيه: إن الـCB هو مادة سامة بشكل حاد عن طريق الاستنشاق أو الابتلاع عن طريق الفم، وهو خطر على المياه. العمل تحت غطاء محرك الدخان مع الحماية المناسبة والتخلص CB وفقا ً ً ً ً ًا ً ً ً ً ً ً واو صحيفة بيانات السلامة (SDS). FA هو تآكل وضارة للبشرة والصحة. العمل تحت غطاء الدخان والرجوع إلى SDS للحصول على معلومات حول المناولة والتخلص.
    3. إعداد لوحة 96 جيدا يشار إليها باسم لوحة الملصقات II وملء 4 آبار لكل رقاقة مع 200 ميكرولتر من حلول لوحة الملصقات الثاني: QDs، PBS / BSA، PBS / BSA، PBS / BSA، PBS / BSA.
      ملاحظة: هنا، يتم استخدام لوحة 24 بئر لرؤية أفضل رقاقة في الآبار. لاستخدام أقل الأجسام المضادة المحاكاة (الخطوة 3.2) و QDs (الخطوة 3.4)، استخدم 96 ألواح البئر لهذه الخطوات.
  2. تسمية HER2 في الخلايا.
    1. مرة واحدة هذه اللوحات جاهزة، بدء وضع العلامات عن طريق وضع الرقائق الدقيقة في آبار الصف الأول من لوحة وضع العلامات 1.
    2. غسل الرقائق الدقيقة مع برنامج تلفزيوني / BSA في لوحة 96 جيدا ملحوظ على أنها لوحة وضع العلامات I.
    3. كتلة مواقع غير محددة لمنع الربط غير محدد من الأجسام المضادة المحاكاة عن طريق احتضان مع PBS / BSA / GS لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. احتضان مع 200 nM الأجسام المضادة ل 10 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    5. غسل رقاقة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني / BSA.
  3. إصلاح الخلايا.
    1. نقل الرقائق الدقيقة إلى لوحة تثبيت جيدا 24 في غطاء الدخان.
      ملاحظة: لا يوجد عمل عقيم مطلوب من هنا.
    2. غسل مرة واحدة مع CB لبضع ثوان.
    3. إصلاح الخلايا مع 3٪ FA لمدة 10 دقيقة.
    4. غسل مرة واحدة مع CB وثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
    5. كتلة مجموعات الألدهيد الحرة من FA عن طريق احتضان مع PBS-الجليسين لمدة 2 دقيقة.
    6. غسل رقائق مع برنامج تلفزيوني-BSA مرة واحدة.
  4. إرفاق QDs.
    1. نقل الرقائق الدقيقة إلى 96 لوحة الملصقات جيدا الثاني.
    2. احتضان مع 20 NM QDs لمدة 12 دقيقة.
    3. غسل الرقائق مع برنامج تلفزيوني / BSA مرتين.
    4. تخزين الرقائق في بئر يحتوي على برنامج تلفزيوني / BSA.

4. المجهر الخفيفة من الخلايا الثابتة

  1. إعداد 3.5 سم قطرها طبق القاع الزجاجي مع 2 مل من برنامج تلفزيوني / BSA الحل.
  2. تأخذ الرقائق الأولى، ووضعها رأسا على عقب (الخلايا التي تواجه أسفل) في طبق أسفل الزجاج ووضع الطبق في المجهر الفلوريسين. خفض رقاقة ببطء في السائل لمنع الضرر على الخلايا.
  3. الحصول على التباين التداخل التفاضلي (DIC) وصور الفلوريسنس لكل رقاقة مع هدف 40x وقناة الفلورسين المناسبة.
    ملاحظة: هنا، يتم استخدام طول موجي مثير من 540-580 نانومتر و طول موجي منبعث من 607-683 نانومتر للكشف عن QD655.
  4. كرر الإجراء للرقاقة الثانية.

5. ما بعد التثبيت

  1. تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان.
  2. ملء 6 آبار لكل رقاقة من 96 بئر لوحة مع 200 ميكرولتر من حلول ما بعد التثبيت:
    CB، الجمعية العامة، CB، برنامج تلفزيوني، برنامج تلفزيوني، برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: الجمعية العامة خطرة على المياه، ضارة للجلد، والجهاز التنفسي، والعينين. العمل تحت غطاء الدخان والرجوع إلى SDS للحصول على معلومات حول المناولة والتخلص.
  3. ضع كلا الرقائق في آبارها مع الخلايا التي تواجهها.
  4. غسل مرة واحدة مع CB.
  5. إصلاح الخلايا مع 2٪ الجمعية العامة لمدة 10 دقيقة.
  6. غسل مرة واحدة مع CB.
  7. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني / BSA.
    ملاحظة: الخطوة التثبيت الأولى مع FA بالفعل بإصلاح البنية البيولوجية ولكن قد لا يزال يحدث انخفاض مستوى انتشار البروتين الغشاء، مما قد يؤدي إلى تصنيف التسمية المستحثة بسبب وجود streptavidins متعددة لكل QD. الحفاظ على الوقت من الخطوات التجريبية من تثبيت FA إلى GA، وبالتالي، قصيرة قدر الإمكان للحد من انتشار البروتينات في الغشاء.
  8. تخزين في PBS / BSA لمنع الصدمات التناضحة و 0.02٪ أزيد الصوديوم (NaN3) لمنع النمو البكتيري في 4 درجة مئوية حتى طلاء الجرافين في لوحة بئر جديدة. ختم لوحة جيدا مع فيلم البارافين لمنع التجفيف. تكون الرقائق الدقيقة والخلايا مستقرة لمدة تصل إلى أسبوعين عند تخزينها عند 4 درجات مئوية.
    تنبيه: NaN3 خطر على المياه وسامة بشكل حاد عن طريق الابتلاع عن طريق الفم، للجلد والجهاز التنفسي. العمل تحت غطاء الدخان والرجوع إلى SDS للحصول على معلومات حول المناولة والتخلص.

6. تنظيف ونقل الجرافين على بلورات الملح

  1. إزالة بولي (ميثاكريلات الميثيل) (PMMA)-الجرافين من PMMA-الجرافين على البوليمر (الشكل 2A).
    1. ماصة بضع قطرات من الماء على البوليمر حول PMMA الجرافين.
      ملاحظة: تأكد من أن الجرافين PMMA-يأتي بسهولة من البوليمر الداعم أثناء تعويمه على سطح الماء.
    2. اغمر الجرافين PMMA-على-بوليمر في الماء بزاوية 30-45 درجة لإطلاق الجرافين PMMA-.
      ملاحظة: يجب أن يكون البوليمر فقط قليلاً. الأنابيب الكثير من الماء على البوليمر رفع وربما أضعاف PMMA-الجرافين.
  2. الملوثات التي تعتمد على النحاس الحفر باستخدام محلول persulfate الصوديوم (الشكل 2B).
    ملاحظة: الجرافين التجاري الذي يزرع على رقائق النحاس غالبا ما يحتوي على بقايا النحاس دون ميكرومتر، والتي يمكن إزالتها مع محلول ننق النحاس22.
    1. إعداد حل 50 مل من 0.42 M persulfate الصوديوم في الماء.
    2. نقل PMMA-الجرافين في محلول persulfate الصوديوم مع الجانب الجرافين إلى أسفل باستخدام شريحة زجاجية قياسية. سوف PMMA الجرافين تطفو على رأس الحل.
    3. اترك الجرافين PMMA-في محلول persulfate الصوديوم بين عشية وضحاها.
    4. إزالة PMMA-الجرافين من محلول persulfate الصوديوم ووضعها على رأس المياه النظيفة باستخدام شريحة زجاجية. دعه يطفو على الماء لمدة نصف ساعة.
    5. كرر الخطوة السابقة ما مجموعه ثلاث مرات لإزالة جميع بقايا persulfate الصوديوم من PMMA-الجرافين.
  3. نقل PMMA الجرافين على كلوريد الصوديوم (NaCl) الكريستال.
    1. إعداد محلول مشبع من NaCl في الماء في طبق بيتري.
    2. نقل PMMA الجرافين على رأس الحل NaCl مع الجانب الجرافين إلى أسفل باستخدام شريحة زجاجية.
    3. عقد الكريستال NaCl مع ملاقط والتقاط العائمة PMMA الجرافين.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم الكريستال NaCl أكبر قليلا من حجم الجرافين PMMA لتجنب طي الجرافين جاحظ على حافة الملح أو الاتصال الجرافين مع ملاقط. في هذه التجارب يتم استخدام الكريستال NaCl من 12 مم × 12 مم × 0.5 مم لالتقاط ورقة جرافين 10 مم × 10 مم ودعمها بعد ذلك.
    4. عقد PMMA-الجرافين على الملح عموديا لمدة 2 دقيقة للسماح للمياه الزائدة تتدفق.
    5. اترك الجرافين PMMA-على الملح جافًا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة واخبزه في فرن عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإزالة الماء تمامًا.
  4. إزالة PMMA باستخدام غسل الأسيتون (الشكل 2C).
    1. سخني الأسيتون في طبق بيتري زجاجي إلى 50 درجة مئوية على لوحة ساخنة في غطاء الدخان. مشاهدة درجة الحرارة بعناية لتجنب الحريق.
    2. تزج PMMA الجرافين على الملح في طبق بيتري مليئة الأسيتون وتركها لحل PMMA لمدة 30 دقيقة.
    3. كرر الخطوة السابقة ما مجموعه ثلاث مرات مع الأسيتون الجديد ونظيف.
    4. السماح للجرافين على الملح الهواء الجاف جيدا قبل استخدامه لإعداد العينة.

7. طلاء الجرافين

ملاحظة: يتم عرض إجراء طلاء الجرافين بشكل تخطيطي في الشكل 3A.

  1. غسل رقاقة واحدة أعدت مع خلايا ثابتة وتسمى HER2 في الماء النقي لإزالة أي مخلفات الملح من المخزن المؤقت. ضع الرقاقة على ورق المرشح. الخلايا مرئية كما البقع الداكنة(الشكل 3B).
  2. قطع الجرافين متعدد الطبقات على كريستال NaCl إلى قطعة تناسب نافذة SiN من رقاقة باستخدام شفرة حلاقة.
  3. إعداد منقار من الماء النقي وإزالة الجرافين من الكريستال NaCl عن طريق إمالة الكريستال حوالي 45 درجة زاوية فيما يتعلق سطح الماء ولمس الماء. سوف تطفو الجرافين على سطح الماء (الشكل 3C).
  4. قبض على الجرافين مع حلقة معدنية من سطح الماء. وسوف تطفو الجرافين داخل قطرة أدناه الحلقة (الشكل 3D).
  5. المس السطح العلوي من رقاقة مع سطح الحلقة السفلى. سوف عصا رقاقة إلى حلقة معدنية. ويمكن رؤية الجرافين على رأس رقاقة (الشكل 3E).
  6. تحت مجسم مجسم، استخدم ورقة التصفية لإزالة الماء المتبقي من الرقائق الدقيقة، بحيث يغطي الجرافين جميع الخلايا على نافذة SiN.
    ملاحظة: الجرافين سوف تتحرك عندما لطخت. تأكد من بقاء الجرافين في الجزء العلوي من النافذة عن طريق لمس الرقاقة فقط مع حافة ورقة التصفية.
  7. استخدم ملاقط لإزالة الرقاقة الدقيقة من حلقة المعادن ووضعها على ورق المرشح. الجرافين مرئياً كوميض أرجواني على الرقاقة (الشكل 3F).
  8. نقل رقاقة من ورقة إلى حجرة طبق بيتري.
  9. ماصة قطرة من الماء في واحدة من المقصورات الحرة وإغلاق الغطاء لتوفير جو مشبع بالماء.
  10. ختم الطبق المقصورة مع فيلم البارافين وتخزينها في الثلاجة في 4 درجة مئوية إذا لزم الأمر لمزيد من القياسات.

8. STEM

  1. ضبط STEM في طاقة شعاع 200 كيلو فولت باستخدام نموذج محاذاة / اختبار لحجم المسبار لا يقل عن 0.2 نانومتر عن طريق ضبط العدسات المكثفة ، وهو تيار المسبار I = 180 pA (يتم توفير معلومات حول تيار المسبار لإعدادات المجهر المختلفة من قبل الشركة المصنعة في حدود دقة 5٪ ) وتقارب شعاع شبه زاوية 13.2 mrad عن طريق إدخال فتحة. قم بتعيين كاشف ADF STEM الذي يفتح نطاق شبه زاوية (داخلي واخارجي) إلى 68-280 mrad عن طريق ضبط إعدادات عدسة البروجيكتور. تعيين حجم الصورة STEM إلى 2048 × 2048 بكسل، و بكسل يسكن وقت t = 6 ميكروغرام.
  2. تحميل رقاقة مع الخلايا المغلفة الجرافين في حامل عينة القياسية لTEM في مثل هذه الطريقة التي تواجه الخلايا.
  3. قم بتحميل الحامل في المجهر الإلكتروني.
  4. الحصول على صورة عامة عند التكبير (M) = 800x (الشكل 4) باستخدام الإعدادات في الخطوة 8.1.
  5. تحديد منطقة ذات أهمية في خلية.
  6. صورة QDs مع كاشف ADF في M = 80000x في حجم بكسل d = 1.3 نانومتر (الشكل 4) باستخدام الإعدادات في الخطوة 8.1.
  7. الحصول على صورة للمنطقة بعد التعرض مع انخفاض التكبير (هنا، M = 50،000x) لإظهار المنطقة المعرضة (الشكل 4).
  8. حساب جرعة الإلكترون
    Equation 3
    حيث e هو تهمة الابتدائية. مع الإعدادات الواردة في أعلاه،
    Equation 4
    وخطأ من 5٪
  9. الحصول على 20 صورة لسلسلة جرعة مع نفس الإعدادات، ولكن مع ر = 60 μs مما أدى إلى جرعة المتراكمة من
    Equation 20.
  10. لتأكيد وجود الجرافين، قم بتبديل المجهر إلى TEM عند M = 1200x، وحدد منطقة بالقرب من الخلية، والتبديل إلى وضع الحيود. سجل نمط انعراج في وقت التعرض 0.5 s, 2048 x 2048 x 3 بكسل, و فتحة منطقة مختارة من 50 ميكرومتر(الشكل 4).
  11. في نهاية الجلسة، قم بإزالة العينة من المجهر، وضع الرقاقة مرة أخرى في طبق المقصورة، وختم الطبق مع فيلم البارافين، وتخزينه في الثلاجة عند 4 درجة مئوية إذا لزم الأمر لإجراء قياسات إضافية.
  12. حدد رقاقة الثانية التي أعدت بنفس الطريقة كما رقاقة الأولى ولكن من دون طلاء الجرافين.
  13. كرر الخطوات 8.2-8.11 ولكن الآن من أجل هذه العينة. سجل نمط انعراج بنفس الإعدادات كما هو الحال في أعلاه ، بالمقارنة (الشكل 4).

9- التحليل

ملاحظة: للكشف الآلي لمواقف QD في صورة STEM، يستخدم التحليل مكونًا إضافيًا للتصميم المحلي لـ ImageJ (NIH)، كما هو موضح في مكان آخر20. البرنامج المساعد هو متاح عند الطلب.

  1. البرنامج تلقائياً تطبيق الخطوات التالية للكشف عن الجسيمات في صورة STEM:
    1. تطبيق مرشح جاوسي للحد من الضوضاء بكسل.
    2. تطبيق سريع فورييه تحويل (FFT) تصفية شريط النطاق للحصول على الجسيمات النانوية فقط.
    3. تعيين عتبة لـ binarize الصورة.
    4. استخدام جسيمات قطرها 10 نانومتر مع عامل التسامح من 2 للكشف عن الجسيمات.
    5. كشف مواقع الجسيمات.
  2. قم بقياس المسافة من المركز إلى المركز بين عشرة أزواج من QDs لكل سلسلة. هنا، تم قياس 10 مسافات مع حجم متفاوتة في كل سلسلة.
  3. حساب التغير النسبي في مسافة الجسيمات عن طريق مقارنة كل مسافة الجسيمات إلى المسافة في الصورة الأولى باستخدام:
    Equation 5.

Representative Results

ويبين الشكل 1A الخلايا المصنفة في مثل هذه الطريقة التي يتم تغطية النافذة ولكن مع مساحة كافية للسماح لهم لتسطيح بها والتمسك بها، مما يؤدي إلى التقاء حوالي 2/3rd (الشكل 1B). في حالة يتم بذر العديد من الخلايا على رقاقة(الشكل 1C)،هناك مساحة غير كافية لجميع الخلايا للتمسك رقاقة. الشكل 1D يظهر نفس رقاقة بعد 24 ح. أكثر من نصف الخلايا لم تتسطح من ناحية أخرى، إذا كانت الخلايا قليلة جداً هي المصنفة (الشكل 1E)،فإن نافذة SiN في نهاية المطاف مع مساحة فارغة كبيرة بعد 24 ح كما رأينا في الشكل 1F. ويبين الشكل 1G صورة DIC للخلايا في الشكل 1A والشكل 1B. ويبين الشكل 1H صورة الفلورس المقابلة الملونة كاذبة باللون الأصفر مما يدل على وضع العلامات الناجحة HER2.

تظهر بيانات العلوم والتكنولوجيا والهندسة والرياضيات التمثيلية في الشكل 4. تم التحقيق في خلايا SKBR3 المغلفة بالجرافين (العمود الأيسر) وغير المغلفة (العمود الأيمن). الشكل 4A،B إظهار M = 800x صور نظرة عامة من الخلايا على النافذة. تم تصوير المناطق المعروضة على أنها insets في M = 80,000x خلال سلسلة الجرعة ، انظر الشكل 4C،D. QDs مرئية كما النقاط المضيئة هنا. الشكل 4E والشكل 4F تظهر M = 50،000x الصور المكبرة المكتسبة في مواقع المستطيلات في الشكل 4C،D. تم تسجيل كل من الصور بعد الحصول على سلسلة جرعة مع D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/Å 2. تم تسجيل سلسلة الجرعة في M = 80،000x. ويمكن التعرف على المناطق المكشوفة على أنها مستطيلات، حيث كان المستطيل مرئياً بوضوح للعينة غير المغلفة(الشكل 4F).

للتحقق من وجود الجرافين، تم الحصول على أنماط الحيود من المناطق التي لا توجد بها خلايا، ولكن مع أو بدون الجرافين على نافذة سي إن. وقد لوحظ الهيكل سداسي الجرافين في نمط الانعراج من عينة المغلفة الجرافين (الشكل 4G) ، في حين كان غائبا عن العينة غير المغلفة (الشكل 4H). نمط الانعراج من الجرافين البلورية واحد سيكون لها ستة أضعاف التماثل بسبب هيكل سداسية مرتبة للغاية من الجرافين. لذلك، فإن بنية سداسية تشير إلى وجود الجرافين على العينات.

ومن أجل تحري تأثير إضاءة شعاع الإلكترون على العينة، تم الحصول على صور STEM في سلسلة صور بجرعة إلكترون متراكمة. تظهر النتائج التمثيلية للعينات غير المغلفة والمغلفة بالجرافين في الشكل 5A-D والشكل 5E-G، على التوالي. تم الحصول على جميع البيانات على حافة الخلية، حيث الخلية هي المسطحة، وبالتالي فإن الهيكل الملاحظ هو الأقرب إلى غشاء سي إن. أدى التعرض للعينات غير المغلفة إلى هياكل ساطعة تظهر على أسطح الخلايا عند D = (1.9 ± 0.1) × 103 e-/ Å2 (الشكل 5B). أصبحت هذه الهياكل أكبر بجرعات أعلى ، لذلك كانت مرئية بوضوح في الصورة الأخيرة للسلسلة عند D = (7.8 ± 0.4) × 103 e-/Å 2 (الشكل 5C ، D). لم تظهر هذه البقع على أي من العينات المغلفة بالجرافين(الشكل 5E-G).

تم إعداد وفحص رقائق إضافية باستخدام البروتوكول الموصوف في ما سبق. وتم التحقيق في ما مجموعه ست عينات مغلفة وسبع عينات غير مغلفة. اثنان من أصل سبع عينات غير مغلفة أظهرت هذه القطع الأثرية. لم تظهر أي من العينات المغلفة أي نقاط مضيئة إضافية.

وكمقياس آخر للأضرار الإشعاعية، تم فحص المسافة بين الـ QDs. إذا حدث ضرر هيكلي، يتوقع المرء أن تتغير المسافات بين QDs. تم قياس التغيرات في المسافات لأزواج مختلفة من QDs مع تراكم D لنطاق من مسافات الزوج. ويبين الشكل 5H أن التغير النسبي للجسيمات بالنسبة للعينات غير المغلفة بقي دون 1.3 في المائة في المتوسط، في حين ظل متوسط المسافة النسبية دون 0.8 في المائة للعينات المغلفة. يمكن للمرء ، لذلك ، أن يستنتج أن طلاء الجرافين استقرت العينة ولكن العينات المجففة دون طلاء الجرافين كانت مستقرة بشكل ملحوظ.

Figure 1
الشكل 1: بذر الخلية على نافذة SiN من رقاقة السيليكون و HER2 المسمى. (أ)صورة مثالية لمنطقة نافذة SiN مع خلايا SKBR3 5 دقيقة بعد البذر على رقاقة. (B) الخلايا نفسها تنتشر على نفس نافذة SiN بعد 24 ح.(C) خلايا SKBR3 على رقاقة Si 5 دقيقة بعد البذر. (D) نفس الخلايا كما في (C) بعد 24 ح. لم الخلايا لا تسطيح بشكل صحيح كما كان هناك الكثير من الخلايا على رقائق على البذر. (E) الخلايا على رقاقة 5 دقيقة بعد البذر. (F) كانت بعض الخلايا فقط مرئية على النافذة لأن عدد قليل جدا من الخلايا كانت تزرع على رقاقة. (G) صورة DIC لنفس الخلايا SKBR3 بعد وضع علامة QD على HER2. (H) صورة تراكب من DIC وصورة الفلورسنسي المقابلة لخلايا SKBR3 المسماة مع HER2-QD655 (الملونة كاذبة باللون الأصفر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تنظيف ونقل الجرافين على بلورات NaCl. (أ) يتم غمر PMMA-الجرافين-على-بوليمر في المياه النقية لإطلاق الجرافين PMMA. يمكن القبض PMMA-الجرافين مع شريحة زجاجية. (ب)تم حفر التلوث القائم على النحاس باستخدام محلول persulfate الصوديوم. لتنظيف الجرافين، تم نقله إلى منقار يحتوي على المياه الأيونية. وتكررت هذه الخطوات 3 مرات. ثم تم نقل الجرافين PMMA إلى محلول مشبع من NaCl في الماء النقي. تم استخدام بلورة NaCl لالتقاط الجرافين من محلول الملح. (C) تم تجفيف الجرافين PMMA على بلورة NaCl لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تمت إزالة PMMA عن طريق احتضان الكتلة في الأسيتون لمدة 30 دقيقة.

Figure 3
الشكل 3: طلاء الجرافين من الخلايا المصنفة على رقاقة Si. (أ)إجراء طلاء الجرافين. يتم تحرير الجرافين على كريستال NaCl على سطح الماء. ثم يتم القبض على قطعة الجرافين مع حلقة معدنية ونقلها إلى رقاقة Si. (B) رقاقة (2.0 × 2.6 ملم) مع نافذة SiN من أبعاد 400 × 160 ميكرومتر دون الجرافين. كانت خلايا SKBR3 مرئية كنقاط داكنة. (C) الجرافين (دائرة حمراء) تطفو على سطح من القارق مليئة بالماء. (D) الجرافين اشتعلت مع حلقة معدنية. (E) رقاقة تعلق على قطرات الماء بحيث الجرافين كان على رأس نافذة SiN. (F) رقاقة بعد طلاء الجرافين. كان الجرافين مرئيًا كوميض أرجواني. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: STEM من الخلايا المغلفة الجرافين وغير المغلفة SKBR3 على نافذة SiN. (أ)صورة STEM لعينة مغلفة من الجرافين تم الحصول عليها في M = 800x.(ب)صورة STEM لعينة غير مغلفة تم الحصول عليها في M = 800x . (C) M = 80،000x صورة مسجلة في موضع المستطيل الأزرق في A. تمثل الخطوط الصفراء أمثلة على المسافات التي تقاس داخل الجسيمات. (D) M = 80000x صورة مسجلة في موضع المستطيل الأزرق في B. يمثل الخط الأصفر أمثلة على المسافات التي تم قياسها داخل الجسيمات. (E) M = 50،000 س صورة من نفس المنطقة C يتعرض لD = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. (F) M = 50،000x صورة من نفس المنطقة كما D وتعرض لD = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. المنطقة المكشوفة شوهدت بوضوح (G) نمط الانعراج لعينة مغلفة بالجرافين من منطقة بدون خلايا. التماثل ستة أضعاف من الجرافين مرئية كما النقاط المضيئة. (H) نمط الحيود من عينة دون الجرافين تظهر أي بقع مضيئة 6 أضعاف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: القطع الأثرية الناشئة على عينات دون طلاء الجرافين. ( أ) الصور الأولى للمناطق على عينات دون طلاء الجرافين المكتسبة في M = 80،000x، وتعرض لD = (0.39 ± 0.02) × 102 ه-/ Å2. (ب) الصور مع القطع الأثرية الأولى الناشئة عند D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/ Å2 (الأسهم الصفراء). (C, D) آخر صورة للسلسلة التي تم الحصول عليها مع D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2. القطع الأثرية كانت مرئية كنقاط مضيئة. (E-G) عينات مغلفة الجرافين دون الناشئة عن القطع الأثرية. (هـ) D = (0.39 ± 0.02) × 102 ه-/Å2 (F) D = (1.94 ± 0.1) × 103 e-/Å2 (G) D = (7.8 ± 0.4) x 103 e-/ Å2. (H) التغير النسبي في المسافات الجسيمية للعينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة. تم تحليل اثنين من العينات غير المغلفة التي تبين القطع الأثرية، واحدة منها مبينة في (A-C)، وآخر صورة من العينة الثانية في D، فضلا عن ثلاث عينات المغلفة (واحد هو مبين في E-G). وفي المجموع، تم فحص عشرة أزواج من QD لكل عينة بمسافات تتراوح بين 250 نانومتر و3 ميكرومتر. ويعكس التغير النسبي متوسط جميع القياسات في مجموعة واحدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: وصفات للحلول والمخازن. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

لفهم أفضل وظيفة البروتين، من المهم الحصول على معلومات حول مواقع البروتين في غشاء البلازما من الخلايا السليمة. وتشمل طرق الحصول على هذه المعلومات المجهر الفلوري فائقة الدقة1،2. على الرغم من أن المجهر فائقة الدقة قد تطورت على مدى السنوات الماضية، لا يزال حلها يقتصر على حوالي 20 نانومتر للظروف العملية للتجارب الخلية، في حين أن البروتينات مستقبلات نموذجية لها أحجام في حدود 1-10 نانومتر. التصوير من البروتينات على خلية واحدة ومستوى جزيء واحد مع دقة كافية لتصور البروتينات هو ممكن مع EM. ولكن بسبب قسم، أساليب EM التقليدية عادة لا تترك الخلية سليمة26، مما يؤدي إلى فقدان المعلومات الهامة حول السياق والتوزيع المكاني للبروتينات في غشاء البلازما. وقد وضعت أساليب للخلايا كاملة مع التبريد-TEM6،فمن الممكن الجمع بين وضع العلامات البروتين مع cryo-EM27،كما ثبت cryo-STEM28. ومع ذلك ، يتم تحسين سير عمل cryo-EM لدراسة البنية الفائقة الخلوية وبنية البروتين ، وليس الكثير لتحليل التوزيعات المكانية للبروتين الغشائي. الحرجة تجفيف نقطة آخر طريقة كاملة لإعداد الخلية ولكن تخضع عينات لعدة خطوات التجفيف ، وتقنية للغاية تستغرق وقتا طويلا29. كما تم فحص البروتينات الغشاء عن طريق تجميد الكسر7. في هذا الأسلوب، يتم إصلاح الخلايا، مجمدة، وكسر. يتم تكرار الأجزاء المكسورة بطبقات الكربون والبلاتين ، ويتم إزالة العينة البيولوجية. ويمكن بعد ذلك أن يتم تحليل النسخ المتماثلة مع EM30. تحليل الخلية بالكامل هو المستحيل مع كسر تجميد لأن المعلومات حول توزيع البروتينات في الغشاء في سياق الخلية كلها يتم فقدان.

الأسلوب المعروض هنا يسمح بدراسة غشاء الخلية دون الحاجة إلى شريحة رقيقة العينة9،31. يتم الاحتفاظ الخلايا سليمة بحيث توطين البروتينات غشاء مرئيا من الصور الفلورية، والتي ترتبط مع الصور EM. وقد أظهرت دراسة البروتينات في الخلية الواحدة ومستوى جزيء واحد داخل الخلايا السليمة في حالة رطبة أن تكون ممكنة مع قرار من 2 نانومتر باستخدام STEM من البروتينات التي تحمل علامة QD باستخدام هذه الطريقة الضميمةالجرافين 9. إن الحفاظ على الخلايا في حالتها الأصلية أمر بالغ الأهمية، لأنه يحافظ على التوزيع المكاني للبروتينات الغشاءية بحيث تكون التحليلات ممكنة على مستوى الخلية الواحدة والجزيء الواحد، وهو أمر مهم لفهم وظائف البروتين، وتطوير أدوية جديدة للنهج العلاجية.

جانب آخر حاسم من التصوير العينات البيولوجية مع EM هو الضرر الإشعاعي للعينات الناجمة عن شعاع الإلكترون. وغالبا ما تشمل الحلول الحد من جرعة الإلكترون قدر الإمكان أو طرق طلاء مختلفة، مثل تغليف العينة بين طبقات رقيقة من الكربون32. يوضح أسلوبنا أن طلاء الجرافين يقلل من القطع الأثرية الناتجة عن الحزم التي تظهر على سطح الخلية للعينات غير المغلفة. فحص العينات البيولوجية الثابتة كيميائيا، والجرافين المغلفة ممكن تحت إشعاع شعاع الإلكترون في 200 طاقة شعاع كيلوفولت تصل إلى D = (7.8 ± 0.4) × 103 ه-/ Å2 دون أضرار الإشعاع، مثل البقع الساطعة، التي تظهر على العينة. بالمقارنة مع أساليب EM الأخرى التي تنطوي على إعداد عينة مفصلة ، على سبيل المثال ، تلطيخ ، تضمين ، (cryo -) قسم ، التكسير ، وما إلى ذلك ، فإن الطريقة الموصوفة هنا أقل استهلاكًا للوقت. يتم وضع العلامات من البروتينات في غضون ساعات قليلة، وطلاء الجرافين يتطلب فقط حوالي 15 دقيقة للباحثين المدربين. إعداد العينة قابل للمقارنة مع الإجراءات اللازمة للمجهر الفلوري.

يمكن تعديل البروتوكول في بعض الخطوات. الجرافين على رقاقة يمكن أيضا أن يكون الهواء المجففة للتأكد من أن الجرافين لا يتحرك عندما لطخت مع ورقة مرشح. إذا كان الجرافين ملوثاً بالملح ، فمن الممكن السماح له بالتعويم على سطح الماء لمدة ساعة واحدة تقريباً لإذابة الملح وبالتالي تقليل التلوث. يمكن تقليل التلوث النحاسي أو PMMA على الجرافين عن طريق تمديد خطوات الحفر المقابلة في البروتوكول. وقد وصفت طرق طلاء الجرافين الأخرى حيث، على سبيل المثال، تم إيداع الجرافين-PMMA مباشرة على الخلايا، وتمت إزالة PMMA عن طريق الغسيل في الأسيتون بعد ذلك33. في طريقتنا، تمت إزالة PMMA قبل الطلاء لتجنب أي ضرر محتمل للخلايا الناجمة عن خطوات غسل الأسيتون إضافية. تم اختيار NaCl كركيزة هنا لأنها مسطحة ، لذلك لا تجعد الجرافين ، وتذوب في الماء لإطلاق سراح الجرافين9. الى جانب ذلك ، يمكن قطعه في الحجم المطلوب ولا تترك أي بقايا الركيزة على الجرافين. ولكن مع أخذ هذه المعايير في الاعتبار، يمكن استخدام ركائز أخرى مثل كلوريد البوتاسيوم أيضا.

للحد من فرصة التكتل المحتمل الذي يسببه التسمية ، يمكن تنفيذ خطوة التثبيت GA مباشرة بعد تثبيت FA ، وبعد ذلك يتم شل جميع البروتينات الغشاء. الخطوة التثبيت الأول مع FA بالفعل بإصلاح الهيكل البيولوجي ولكن انخفاض مستوى انتشار البروتين غشاء قد تحدث لا يزال34،وربما يؤدي إلى التكتلات المستحثة التسمية بسبب وجود متعددة Streptavidin لكل QD. التثبيت مع الجمعية العامة قد يؤدي إلى إشارة autofluorescence أثناء LM، وبالتالي، يتم بعد LM في البروتوكول الموصوف ولكن يمكن تخفيض كما هو موضح في مكان آخر34. Cacodylate العازلة هي سامة جدا، والمثبتات الأخرى يمكن استخدامها كذلك، ولكن يستخدم cacodylate هنا كما هو العازلة المستخدمة عادة لبروتوكولات م، يتجنب الترسبات، ويمنع نمو البكتيريا والفطريات، ومتوافق مع أيونات الكالسيوم التي هي ضرورية للحفاظ على سلامة ultrastructural من الأغشية الدهنية35. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام أكسيد التراكسيد الأوزميوم كتشل تثبيت إضافية لتثبيت الدهون. وهذا من شأنه أن يساعد على تعزيز التباين في بنية الخلية، ولكن أيضا إضافة معدن آخر إلى النظام والحد من التباين التي تم الحصول عليها على QDs.

يحتوي البروتوكول الموضح هنا على العديد من الخطوات التي تتطلب تعليمات جيدة. مطلوب بعض التدريب قبل التعامل مع الرقائق الدقيقة لتجنب خدش سطح سي إن من الرقائق الدقيقة ومنع الكسر. كما ذكر من قبل، فمن المستحسن لإعداد الرقائق الدقيقة في التكرارات كما يمكن أن تنكسر نافذة SiN من وقت لآخر. الحصول على العدد المطلوب من الخلايا على رقاقة يتطلب أيضا بعض الخبرة. طلاء الخلايا مع الجرافين يحتاج إلى بعض التدريب لأنه يمكن أن يكون من الصعب العثور على زاوية الميل الحق لتعويم الجرافين على الماء. عند اصطياد الجرافين من الماء ، قد يكون من الصعب أيضًا رؤية الجرافين الرقيق. بمجرد أن يكون الجرافين على الرقاقة ، يجب أن يتم لطخ المياه الزائدة بورقة تصفية. وينبغي أن يتم ذلك فقط مع غيض من ورقة مرشح مثل لتجنب إزالة الجرافين من رقاقة.

طلاء الجرافين منع القطع الأثرية من الظهور على العينة. ولكن لD < 4 × 102 ه-/Å2 أيضا لم تظهر أي قطع أثرية للعينة غير المغلفة، وظهرت القطع الأثرية لعينات غير مغلفة فقط 2. وهكذا، يبدو أن فحوصات الخلايا غير المغلفة ممكنة أيضًا، على الرغم من أنه سيكون من الأفضل استخدام الجرافين وتجنب خطر تكوين القطع الأثرية. ويمكن تحليل تكوين هذه القطع الأثرية في المستقبل لإعطاء تلميحات حول كيفية منع تشكيلها. فيما يتعلق باستقران الهيكلية للخلايا فقط لوحظ تحسن طفيف من طلاء الجرافين. وقد استقرت الخلايا الثابتة على ما يبدو في المناطق الرقيقة التي تم فحصها، حيث كان هيكلها على مقربة من غشاء سي إن. ما لم ندرس هنا، ومع ذلك، كانت تجفيف التحف التي من المعروف أن تحدث للعينات الخلوية عندما تتعرض للفراغ4. من شأن تجفيف الخلايا يؤدي إلى انكماش الخلايا بحيث أيضا مسافات QD سوف تتغير نتيجة لذلك. بالنسبة لجرعة الإلكترون المستخدمة هنا ، ظلت مسافة QDs للعينات المغلفة بالجرافين وغير المغلفة مستقرة. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لدراسة تأثير طلاء الجرافين على الخلايا لM.

أحد القيود على هذه الطريقة هو أن تثبيت المواد الكيميائية للخلايا ضروري؛ لذلك، لا يمكن إجراء أية تجارب الخلية المباشرة. ولكن في حالة عدم الحاجة إلى وضع العلامات واستخدام الخلايا ذات الاستقرار الهيكلي العالي ، على سبيل المثال البكتيريا ، يمكن وضع الخلايا غير المثبتة في الجرافين لـ EM36 وإن كان مع تحمل جرعة إلكترون مختلفة. أيضا، البروتينات غير قابلة للكشف مباشرة، لذلك هناك حاجة QDs لتصور البروتينات. سوف تستفيد الطريقة من تسميات أصغر. نقطة النقاش هي ما إذا كان من الجيد أو السيئ أن البنية الفائقة ليست مرئية بوضوح. أسلوبنا مشابه لتلك التي من المجهر الفلوريسين حيث البروتينات المختارة فقط مرئية37. زيادة وضوح البنية الفائقة أيضا إضافة المزيد من المعلومات إلى الصورة، ثم في مرحلة ما منع الكشف عن مواقع التسمية الفردية. وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المذكورة هنا هي لأنواع بروتينية واحدة، وهناك حاجة إلى إضافات البروتوكول لتكون قادرة على تسمية البروتينات المتعددة. وأخيراً، تعمل الطريقة عندما يتوفر جزيء صغير من التقارب العالي ملزم على وجه التحديد مثل الأجسام المضادة21 أو الأجسام النانوية38. الأجسام المضادة المستخدمة عادة أكبر بكثير، ومن شأنها أن تمنع الكشف عن الحالة الوظيفية لالوحدات الفرعية البروتين في oligomers.

طريقتنا مفيدة لدراسة وظيفة البروتين على الخلايا الكاملة باستخدام EM مع الحفاظ على الخلايا في حالة رطبة. من الممكن بسهولة فحص سلسلة من الخلايا. ويمكن دراسة نوع آخر من الخلايا والبروتينات كذلك. إذا لم تكن هناك حاجة لوضع العلامات البروتينية، يمكن استخدام مجموعة فرعية من البروتوكول لطلاء الجرافين من مجموعة واسعة من العينات البيولوجية. القدرة على دراسة الخلايا كلها ذات الصلة في البحوث الخلوية لفهم الارتباطات وظيفة البروتين الغشاء على المستوى الجزيئي.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نشكر د. ب. بيكس على مساعدته في بروتوكول ثقافة الخلية، و ف. واينبرغ على مراجعة المخطوطة، و ت. Trampert للمساعدة في التجارب والأرقام، س. سمولكا للمساعدة في الأرقام، وإ. أرزت لدعمه من خلال INM. يتم تمويل هذا البحث من قبل Kröner-Fresenius-Stiftung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone for HPLC (min. 99.8 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2626-1L
AL54 analytical balance Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Germany 30029077
Albumin Fraction V, biotin-free, ≥ 98 %, for molecular biology Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 0163.2
Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin conjugated 20 µM Affibody, Solna, Sweden 10.0817.02.0001
atomic resolution analytical microscope JEM-ARM200F JEOL (Germany) GmbH, Freising, Germany
Boric Acid Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany B6768-500G
Cacodylic acid sodium salt trihydrate ≥ 98 % Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 5169.1
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 50ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696781
Cell Culture Flasks, PS, treated, sterile, Filter screw cap 250ml Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696782
Cell Culture Multiwell plates, treated, 24-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696792
Cell Culture Multiwell plates, treated, 96-well Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696794
CELLSTAR Cell Culture Flasks TC treated, 250 ml Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 658170
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plates 96-well Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 655180
CELLSTAR Centrifuge Tubes 15 ml sterile Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 188271
CELLview cell culture dish, PS, 35/10mm, glass bottom, 1 compartment Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany 627861
Centrifuge 5418 Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 5401000010
Centrifuge Tubes 50 ml sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 7696705
Corning CellStripper non-enzymatic cell dissociation solution Corning, NY, USA 25-056-CI
D(+)-Saccharose min. 99,7 %, powdered Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 9286.1
Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer improved Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany PK36.1
Easypet Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 4430000018
Eppendorf Research plus pipettes variable, 0.1 - 2.5 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000012
Eppendorf Research plus pipette variable, 2 -20 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000039
Eppendorf Research plus pipette variable, 10 - 100 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000047
Eppendorf Research plus pipette variable, 100 - 1000 µl Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany 3123000063
Ethanol absolute for HPLC (min. 99.9 %) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2222-1L
Fibronectin-like engineered protein*poly mer-plus Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany F8141
Fluorescence Microscope Leica DMI6000 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany
Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate FisherScientific, Hampton, NH, USA 31966021
Gibco Fetal Calf Serum (FCS) FisherScientific, Hampton, NH, USA 10099141 lot number: 1751893
Gibco Goat Serum, New Zealand origin FisherScientific, Hampton, NH, USA 16210064 lot number: 1788320
Gibco Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA 10010015
Galaxy 48R CO2 Incubator New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Germany CO48310001
Gatan Model 950 Solarus— Plasma Cleaner Gatan GmbH, München, Germany
Glutaraldehyde solution Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany G5882
Glycine ≥ 98.5 % Ph.Eur., USP, BP Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany T873.1
Inverted Laboratory Microscope Leica DM IL LED Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany DM IL LED
Hot plate Heidolph Instruments GmbH & CO. KG, Schwabach, Germany MR 3002
MEM non-essential Aminoacids (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine Biowest, Nuaillé, France X0557-100
Microscope glass slides 76 mm x 26 mm DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main
micro tubes (1.5 ml, 2 ml) non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1.5 ml: 7696751, 2 ml: 7696752
MSc-Advantage— Class II Biological Safety Cabinet ThermoFisher Scientific, Waltham, USA
Ocean Microchips SiN window 400x150 µm, 200 nm spacer DENSsolutions, Delft, The Netherlands
Omnifix Single-use syringe Luer Lock Solo (10 ml, 20 ml, 50 ml) B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany 10 mL: C542.1 20 ml: T550.1 purchased via Carl Roth GmbH&Co. KG, Karlsruhe
Oven Memmert GmbH + Co. KG, Schwabach, Germany VO 200
Parafilm VWR, Darmstadt, Germany #291-0057
Paraformaldehyde 16 % solution, EM grade Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 15710
Perfekt-Kescher with handle Plano GmbH, Wetzlar, Germany T5112
Pipette tips with aerosol barrier in racks, non-sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 2-200µl: 7695892
Pipette tips with aerosol barrier in racks, sterile Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 0.1-10 µl: 7695880 2-100 µl: 7695883 100-1000 µl: 7695886 1250 µl XL: 7695887
Poly-L-Lysine 0.01 % solution mol.WT.70.000 - 150.000 Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany P4707
Qdot 655 Streptavidin Conjugate 1 µM Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA Q10121MP
Razor blade, Gem Uncoated 3 Facet, Steel Back, Degreased Personna, AccuTec Blades, Verona, VA, USA 94-0451
round filter paper, ashless, Grade 589/3 blue ribbon, diam. 150mm Schleicher & Schuell, Dassel, Germany 300212
Routine stereo Microscope Leica M60 Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany M60
Serological ROTILABO pipettes, sterile (1 ml, 2 ml, 10 ml) Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1 ml: N231.1 2 ml: N236.1 10 ml: ET30.1
Serological pipettes, sterile, (1 ml, 2 ml, 10ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 1ml: 7695550 2ml: 7695551 10ml: 7695553
Serological pipettes, sterile, (5 ml, 25 ml, 50 ml) Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Germany 5 mL: 7695552 25ml: 7695554 50ml: 7695555
Shaking water bath SW22 Julabo GmbH, Seelbach, Germany 9550322
Sodium chloride Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany HN00.1
Sodium chloride crystals, cleaved 12 mm x 12 mm x 0.5-1 mm International Crystal Laboratories, Garfield, NJ, USA 9750
Sodium tetraborate decahydrate, ACS reagent, ≥ 99.5 % Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany S9640-500G
Sodium persulfate carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany 4365.2
syringe filters ROTILABO PES, sterile 0.22 µm Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany P668.1
Trivial Transfer Graphene 3-5layers, 1 cm x 1 cm ACS material, Pasadena, CA, USA TTG30011
Tweezers Dumoxel 03 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0103-7-PO
Tweezers Inox 02 Manufactures D’Outils Dumont SA, Montignez, Switzerland 0102-7-PO
Tweezers, plastic replaceable tip Ideal-tek SA, Balerna, Switzerland 5SVR.SA
Water ROTISOLV HPLC gradient grade Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Germany A511.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy. Science. 361 (6405), 880-887 (2018).
  3. Williams, D. B., Carter, C. B. The Transmission Electron Microscope. , Springer. (2009).
  4. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists. , Jones and Barlett Publishers. (1999).
  5. Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology. Methods. 100, 3-15 (2016).
  6. Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).
  7. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), e51694 (2014).
  8. Nishiyama, H., et al. Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film. Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).
  9. Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
  10. Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM). Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).
  11. Kinoshita, T., et al. Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).
  12. Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching. Journal of Visualized Experiments. (135), e57665 (2018).
  13. Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).
  14. Meng, F., et al. Graphene-Based Fibers: A Review. Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).
  15. Sun, P. Z., et al. Limits on gas impermeability of graphene. Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).
  16. Kato, R., et al. High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM. Carbon. 160, 107-112 (2020).
  17. Keskin, S., de Jonge, N. Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells. Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).
  18. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nature Methods. 2, 743-749 (2005).
  19. Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).
  20. Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy. Science Advances. 1 (6), 1500165 (2015).
  21. Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).
  22. Textor, M., de Jonge, N. Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).
  23. Henjes, F., et al. Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs. Oncogenesis. 1, 16 (2012).
  24. Peckys, D. B., de Jonge, N. Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (103), e53186 (2015).
  25. Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. Serum starvation: caveat emptor. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).
  26. Kohl, H., Reimer, L. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
  27. Yi, H., et al. Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).
  28. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells. Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).
  29. Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy. Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).
  30. Meier, C., Beckmann, A. Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro. Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).
  31. Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells. Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).
  32. Egerton, R. F. Control of radiation damage in the TEM. Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).
  33. Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells. Nature Communications. 6, 7384 (2015).
  34. Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation. Scientific Reports. 8 (1), 17756 (2018).
  35. Glauert, A. M., Lewis, P. R. Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , Princeton University Press. (2014).
  36. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  37. Pawley, J. B. Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn. , Springer. (1995).
  38. Chung, I., et al. Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells. Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).

Tags

علم الأحياء، العدد 163، الجرافين، الجسيمات النانوية، الخلية بأكملها، رطب، المسح الضوئي المجهر الإلكترون انتقال، STEM، البروتينات الأغشية، أضرار الإشعاع
حاوية الجرافين من خلايا الثدييات الثابتة كيميائياً للمجهر الإلكتروني للمرحلة السائلة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N.… More

Blach, P., Keskin, S., de Jonge, N. Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (163), e61458, doi:10.3791/61458 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter