קוונפיקציה של אזור הדבקה בתשתית התא והפצות צורות התא ב-MCF7 Cell Monolayers
Summary
המאמר מתאר את הכמת של 1) את גודל ומספר של הידעיות מיקוד ו 2) אינדקס צורת תא ואת ההתפלגות שלה מתוך תמונות קונפוקלית וקד של המונאולאיירס הקונאולית של תאים MCF7.
Abstract
השיטות המוצגות כאן מכמת כמה פרמטרים של תא מדומה מונואולאן מדומה מספר תמונות ויטראז ‘ מרובים: הדבקה למצע כפונקציה של מספר וגודל של מיקוד מוקד, וצורה תא, מאופיין על ידי מדד צורת התא ומתארי צורה אחרים. הידקויות מיקוד היו מדמיינו על ידי כתמים פקעבלין וגבולות תא התא סומנו על ידי הצומת פלקוטין ו actin. השיטות לתרבית תאים וכתמים היו סטנדרטיים; תמונות מייצגות מטוסי מוקד יחידים; ניתוח תמונה בוצעה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה זמינה לציבור. הפרוטוקולים המוצגים משמשים כדי לכמת את מספר וגודל של הידקויות מיקוד ואת ההבדלים בפיזור הצורה התא ב monolayers, אבל הם יכולים להיות מחדש עבור כימות של גודל וצורה של כל מבנה הסלולר ברורים אחרים, כי יכול להיות מוכתם (למשל, המיטוa או גרעיני). הערכת פרמטרים אלה חשובה באפיון הכוחות הדינמיים בשכבת התא החסיד, כולל הדבקה בתאים וכיוונון actomyosin המשפיע על צורת התא.
Introduction
תאי אפיתל monolayers לפעול כקולקטיב שבו תא תא ותא הדבקה, כמו גם כוחות ומתחים והמתיחות מייצגים פרמטרים חשובים האיזון הנכון שלהם תורמת השלמות הכוללת של היחידה1,2,3. לפיכך, הערכת פרמטרים אלה מייצגת דרך ליצירת המצב הנוכחי של שכבת התא.
שתי השיטות המתוארות כאן מייצגות ניתוח דו מימדי של המונאולאיירס הקונקולני של חסיד, תאי אפיתל (במקרה זה MCF7 סרטן השד קו התאים). הניתוח מבוצע באמצעות תמונות מיקוד (Z-פרוסות בודדות) מאזורים שונים על ציר Z; אזור בסיס ליד מצע למדידות מיקוד (FA) ולאזור אפיפיורי למדידות בצורת תא. השיטות המוצגות פשוטות יחסית ודורשות טכניקות סטנדרטיות של מעבדה ותוכנות קוד פתוח. מיקרוסקופ confocal וקד מספיק עבור פרוטוקול זה, כך שניתן לבצע מבלי להעסיק TIRF מיוחדים יותר (כולל השתקפות פנימית השתקפויות פלואורסצנטית) מיקרוסקופ. לפיכך, ניתן ליישם את הפרוטוקול במסגרת מעבדה סטנדרטית יחסית. למרות שרמת הדיוק של השיטות מוגבלת, הם יכולים להבחין בין הבדלים בסיסיים בצורה מוקד ובצורת תא.
שתי השיטות המתוארות כאן כוללות את ההליכים הניסיוניים הסטנדרטיים כגון כגון תא, כתמים, דימות ממוקד וניתוח תמונה שבוצעו באמצעות ImageJ. עם זאת, ניתן להשתמש בכל תוכנה לעיבוד תמונה עם הפונקציות המתאימות. השיטות שהוצגו יכול לעקוב ולהשוות שינויים שנגרמו על ידי טיפול תרופתי או שינוי גנטי מינימלי. השגת ערכים מסוימים אינה מומלצת, בשל הדיוק המוגבל של שיטות אלה. שתי פקודות מאקרו אוטומטיות נכללו, כדי להקל על המדידות של תמונות רבות.
Protocol
Representative Results
Discussion
תא תא ותא הדבקה של תא מהווים תכונות הטבועה של התאים אפיתל לשחק את התפקיד הקריטי ברקמות מורפולגנזה ו embriogenesis. ברקמות למבוגרים את הרגולציה הנכונה של תכונות מכניות של שכבת התא היא חיונית לשמירה על הומאוסטזיס ומניעת תגובות פתולוגיים כמו התקדמות הגידול גרורות. הגודל והמספר של הידקויות מיקוד ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדע הפולני תחת מענק מס ‘ 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
References
- Li, D. S., Zimmermann, J., Levine, H. Modeling closure of circular wounds through coordinated collective motion. Search Results. 13 (1), 016006 (2016).
- Ilina, O., Friedl, P. Mechanisms of collective cell migration at a glance. Journal of Cell Science. 122, 3203-3208 (2009).
- Ladoux, B., Mege, R. M. Mechanobiology of collective cell behaviours. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (12), 743-757 (2017).
- Stossi, F., et al. High throughput microscopy identifies bisphenol AP, a bisphenol A analog, as a novel AR down-regulator. Oncotarget. 7 (13), 16962-16974 (2016).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Andrey, P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 32 (22), 3532-3534 (2016).
- Balcerak, A., et al. HAX1 impact on collective cell migration, cell adhesion, and cell shape is linked to the regulation of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 30 (25), 3024-3036 (2019).
- Buskermolen, A. B. C., Kurniawan, N. A., Bouten, C. V. C. An automated quantitative analysis of cell, nucleus and focal adhesion morphology. PLoS One. 13 (3), 0195201 (2018).
- Fokkelman, M., et al. Cellular adhesome screen identifies critical modulators of focal adhesion dynamics, cellular traction forces and cell migration behaviour. Scientific Reports. 6, 31707 (2016).
- Horzum, U., Ozdil, B., Pesen-Okvur, D. Step-by-step quantitative analysis of focal adhesions. MethodsX. 1, 56-59 (2014).
- Kim, D. H., Wirtz, D. Focal adhesion size uniquely predicts cell migration. FASEB Journal. 27 (4), 1351-1361 (2013).
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. Journal of Microscopy. 227, 140-156 (2007).
- Tsygankov, D., et al. CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. Journal of Cell Biology. 204 (3), 443-460 (2014).
- Tiryaki, V. M., Adia-Nimuwa, U., Ayres, V. M., Ahmed, I., Shreiber, D. I. Texture-based segmentation and a new cell shape index for quantitative analysis of cell spreading in AFM images. Cytometry A. 87 (12), 1090-1100 (2015).
- Tong, J., et al. Cell micropatterning reveals the modulatory effect of cell shape on proliferation through intracellular calcium transients. Biochimica et Biophysica Acta. 1864 (12), 2389-2401 (2017).
- Vartanian, K. B., Kirkpatrick, S. J., Hanson, S. R., Hinds, M. T. Endothelial cell cytoskeletal alignment independent of fluid shear stress on micropatterned surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 787-792 (2008).
